基因工程研究技术教程分析.ppt

基因工程研究技术 所有的分子生物学技术都是基于对核酸和蛋白质性质研究的基础上发展的 杂交： the base-pairing characteristics of DNA and RNA PCR： Thermophilic DNA polymerase DNA克隆：DNA polymerase, restriction endonucleases and DNA ligase 1. 核酸研究技术 电泳分离：Separation by Electrophoresis 限制性内切酶切割：Cut by Restriction endonuclease 杂交鉴定： Identification by Hybridization PCR扩增： Amplification by PCR DNA克隆和基因表达：DNA Cloning and gene expression DNA文库的构建和目的基因的筛选（Construction of DNA library screening of target gene) 基因组序列和分析：Genome sequence analysis 1. 凝胶电泳是根据DNA和RNA的分子量大小、拓扑结构等性质进行分离 一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率； 电泳的迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。 Gel matrix (胶支持物) 胶支持物是凝胶状的多孔物质，能允许DNA分子通过其内部的孔隙。 琼脂糖（ Agarose） 聚丙烯酰胺（ Polyacrylamide） 溴化乙锭（ＥＢ） ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或者ＲＮＡ相邻碱基之间，在300nm波长的紫外线照射下发出荧光。 当DNA和RNA用EB充分处理之后，其荧光强度与其分子量大小呈正比 2. 限制性内切酶在特定位点切割DNA分子 识别位点 粘性末端 平末端 同裂酶 同尾酶 3. DNA杂交-确定特殊的DNA分子 杂交（Hybridization):不同来源的单链DNA或者RNA通过碱基配对形成互补结构的过程 探针-Probe 探针：一段带有特殊标记的核苷酸序列，可以用来从混合的核苷酸中寻找含有与其序列互补的核苷酸序列。 将要用探针杂交的混合核苷酸可以在电泳分离后的凝胶上，也可以在一个文库的不同的克隆中。 探针在杂交之前需要进行标记，以便于在探针与目标序列杂交后能够被检测出。 探针的标记 Radioactive labeling: display and/or magnify the signals by radioactivity. Non-radioactive labeling: display and/or magnify the signals by antigen labeling: antibody binding – enzyme binding - substrate application (signal release) 探针杂交可以确认电泳分离后的DNA和RNA Southern blotting ：将变性处理的后的DNA片段进行凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素薄膜，再用放射性标记的探针进行杂交以显示这些DNA，这种技术成为Southern blotting 。 Northern blotting ：将RNA从琼脂糖凝胶电泳转移至转移至硝酸纤维素薄膜，再用放射性标记的探针进行杂交的技术。其原理与Southern blotting类似。 Western blotting Western blotting：又称为蛋白质印迹法，用来检测在不均一的蛋白质样品中是否存在目标蛋白质的技术。 操作程序与Soutern blotting类似。先将蛋白质经过SDS电泳分离，然后转移至醋酸纤维素薄膜之类的固体支持物上，通过专一性抗体探测目标蛋白质；随后用标记的第二抗体检测在印迹中是否存在免疫复合物（一抗与抗原的复合物）。 4. 聚合酶链式反应(PCR) PCR is to used to amplify a DNA sequence using a pair of primers each complementary to one end of the DNA target sequence. 反向PCR- reverse PCR 先用一种在靶DNA区段上没有识别位点的核酸内切限制酶，从距靶DNA区段有一定距离的两侧位置切割DNA分子，然后将这些片段作分子内连接成环形。根据已知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的未知DNA序列。 PCR技术不仅可以扩增DNA