基因组测序技术教程分析.pptVIP

新一代测序技术 —— 454基因组测序技术 背景介绍 DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程，它已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术予以解决。 迄今为止，我们获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的。但在过去几年，大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。目前，新的测序技术及手段还在不断涌现，比如最新的进展就包括建立序列数据库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。 新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。 测序策略 454基因组测序使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法（cyclic-array sequencing），也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。 所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。 与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广泛的应用。 测序策略 图a为高通量鸟枪Sanger测序法策略 图b为鸟枪循环芯片测序法策略 测序原理 在体外构建好的两端带接头的单链DNA文库在一个油包水的乳液环境中进行PCR扩增，因为起始阶段模板浓度非常低，因此，大部分包还有磁珠的为乳液滴都只含有一种模板，经PCR扩增后，每个磁珠只连有一种模板的扩增产物，然后打破为乳液滴，收集磁珠，加入芯片中。 测序原理 经乳液PCR法扩增后携带有大量模板的磁珠被放置到芯片上的微孔中。随后使用焦磷酸法测序，每一轮反应都会掺入一个核苷酸，同时释放一个焦磷酸，然后焦磷酸和腺苷酰硫酸在磷酸化酶的催化下生成ATP，然后荧光素酶就可以在ATP参与下将荧光素转化为氧化荧光素，同时发出荧光被检测器检测到。 工作流程 文库制备 乳液PCR 焦磷酸测序 加入含酶小微珠 芯片制备 工作流程 一.样品输入并片段化 大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。 工作流程 二.文库制备 借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。 工作流程 三.一个DNA片段连接一个磁珠 单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。 工作流程 四.乳液PCR扩增 每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。 工作流程 五.测序 携带DNA的捕获磁珠（20um）随后放入PTP板（Pico?TiterPlate）的微孔（29um）中进行后继的测序反应。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号。由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。 工作流程 六.数据分析 454测序系统可以在10小时的运行当中获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息。并提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。 454测序系统图示 A为液体试剂供应装置 B为反应池 C为光线检测成像系统和计算机控制系统 测序质量 454测序技术的准确率在99%以上。其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生误差。因此，454测序平台的主要错误类型是插入-缺失