发酵工业菌种：教案分析.pptVIP

* 2.4.2 常规育种 包括诱变和筛选，是最常用的菌种改良手段。其理论基础是基因突变。关键是用物理、化学或生物的方法修改目的微生物的基因组（genome），产生突变型。微生物的自发突变频率在10-8~10-5之间，经诱变剂处理微生物细胞后，可达到10-6~10-3。 常用诱变剂 物理：紫外线、微波… 化学：NTG（N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍）、氯化锂、羟胺（NH2OH）… 生物：噬菌体、质粒、DNA转座子… 2.4 发酵工业菌种改良 2.4.2 常规育种 诱变育种中需考虑的因素 （1）选择合适的出发菌株 产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。 需对其产量、形态、生理等有足够了解。 （2）复合诱变剂的使用 不同诱变剂致变机理不同。尤其对已经诱变过的老菌种可考虑。 （3）诱变剂量的选择 致死率与诱变率之间有一定关系。 （4）变异菌株的筛选 从菌落形态变异类型着手，发现与产量和其他优良特性相关的特征。 2.4 发酵工业菌种改良 2.4.2 常规育种 筛选方法 至关重要！！！ （1）平皿快速检测法 肉眼可观察的变化。显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法… （2）形态变异的利用 （3）高通量筛选(high throughput screening) 2.4 发酵工业菌种改良 2.4.3 细胞工程育种 包括杂交育种和原生质体融合育种，其特点是在细胞水平上对菌种进行操作，采用杂交、接合、转化和转导等遗传学方法，将不同菌种的遗传物质进行交换、重组，使不同菌种的优良性状集中在重组体中，从而提高产量。 杂交育种 应有适当的遗传标记（如营养缺陷型标记、抗性标记、温度敏感型标记等）以筛选重组体。 原生质体融合 细胞壁的处理 2.4 发酵工业菌种改良 2.4.4 基于代谢调节的育种技术 通过对特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的生产或切断支路代谢途径以及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累的方向进行。 组成型突变株的选育 抗分解调节突变株的选育 营养缺陷型突变株的选育与应用 抗反馈调节突变株的选育 细胞膜透性突变株的选育 2.4 发酵工业菌种改良 2.4.5 基因工程育种（蛋白质工程育种、组合生物合成育种、反向生物工程育种） 以细胞外进行DNA拼接、重组技术为基础的基因工程，是以人们可控制的方式来分离和操作特定的基因。可以创造新的物种，能赋予微生物新的机能，使其生产出原本不能合成的新物质，或增强其原有的合成能力。 2.4 发酵工业菌种改良 人造细胞的出现 /wiki/Mycoplasma_laboratorium /wiki/Craig_Venter John Craig Venter 大肠杆菌代谢工程 基因敲入knock in 基因敲除knockout 启动子改造 RNA聚合酶改造 … MIT Stephanopoulos group Reference Alper H and Stephanopoulos G. Metab Eng 2007 Nevoigt E, Stephanopoulos G. Biotechnol Bioeng 2007 Alper H, Stephanopoulos G. Appl Microbiol Biotechnol 2006 Alper H, Stephanopoulos G. PNAS 2005 / Synthetic Biology is A) the design and construction of new biological parts, devices, and systems, andB) the re-design of existing, natural biological systems for useful purposes. 合成生物学 番茄红素 lycopene 酶的普遍特点 1、催化效率高 2、特异性高 3、反应条件温和 水溶液中反应，常温，常压，pH中性… 基因工程菌生产重组酶 如果对自然界中的酶还不满意？ Novozyme已有超过80%的酶是由基因工程菌株生产！ 对酶进行改造！ 重组酶的制造过程 重组酶的表达 目的基因 合适的宿主 合适的质粒 + 通过基因的改变对酶分子进行改造 酶分子的改造 理性设计 — 有针对性的改造 定点突变、融合蛋白… 定向进化 — 随机突变+定向选择 易错PCR、DNA改组… Directed evoluti