第十章外源基因表达.ppt

第十章 外源基因的表达 *楼士林《基因工程》p362 参考杨汝德《基因工程》p164 p376 p378 P378 杨汝德p166 附表：p380 P382 杨汝德p167 P384 杨p168 转座子（transposon，Tn）：是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。最简单的转座子不含任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。转座子常被定位到特定的基因中，造成该基因的突变。【引自朱玉贤《现代分子生物学》（第一版）p50】。 *参考吴乃虎《基因工程原理》（第二版）p183~p186 p388 参考王关林《植物基因工程》p523 参考王关林《植物基因工程》p527 参考杨汝德《基因工程》p148 PL和 PR启动子是大肠杆菌λ噬菌体中控制早期转录的启动子。 基因沉默（gene silencing）是导致外源基因不能正常表达的重要因素。 p345 p346 真核生物转录启动自学。 p350 自学 p354 参考王关林《植物基因工程》p586 王关林《植物基因工程》p591 3.7.4 提高外源基因在植物细胞中表达效率的策略 选择合适的启动子类型（如组织特异性启动子、强启动子等） 组入完整的基因表达调控序列（包括5′调控序列和3′调控序列） 合理插入内含子 合理使用转译过程中的调控序列 正确利用增强子 防止外源基因失活 优化先导序列、提高翻译效率。 4 基因表达产物的检测与分离纯化 4.1 基因表达产物的检测 外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。 检测特异性mRNA的方法 Northern杂交法 检测特异性蛋白质的方法 生化反应检测法 免疫学检测法 生物学活性检测法 当转化的外源目的基因表达产物没有可供直接检测的性质时，可把外源基因与标记基因或报告基因一起构成嵌合基因，通过检测嵌合基因中的标记基因或报告基因间接确定外源目的基因的存在和表达。 4.1.1 外源基因转录产物的检测 Southern杂交可以检测到外源基因是否存在于受体细胞中，但不能确定外源基因是否转录。而利用Northern杂交技术可以检测外源基因是否转录出mRNA。 Northern与 Southern杂交过程类似，主要包括以下几个步骤： 提取总RNA 分离mRNA。 制备RNA探针。 Northern杂交。 检测外源基因转录产物还可采用RT-PCR的方法。 4.1.2 报告基因的酶法检测 报告基因必须具备两大特点： 其表达产物及其功能在未转化的植物细胞中并不存在； 其表达产物便于检测。 目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因，主要有β-葡萄糖苷酸酶基因（gus基因）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat基因）、冠瘿碱合成酶基因（胭脂碱合成酶基因、章鱼碱合成酶基因）、抗卡那霉素基因（npt-Ⅱ基因）等。 cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA转向氯霉素，而乙酰化的氯霉素不再具有氯霉素的活性，失去了干扰蛋白质合成的作用。真核细胞不含氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源性活性，因而cat基因可作为真核细胞转化的标记基因及报告基因。cat基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性，并可通过对转化细胞中氯霉素乙酰转移酶活性的检测来了解外源基因的表达。 cat的活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物乙酰化氯霉素及还原型CoASH的生成来测定，目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。 cat（氯霉素乙酰转移酶）基因的检测 氯霉素最早是从放线菌属委内瑞拉链霉菌中分离出来的，现在使用的是化学合成品。氯霉素能选择地与原核细胞50S亚基或真核细胞线粒体核糖体大亚基结合，抑制蛋白质合成。 gus（ β-葡萄糖苷酸酶）基因的检测 gus基因存在于某些细菌体内，编码β-葡萄糖苷酸酶，该酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的gus活性，许多细菌及真菌也缺乏内源gus活性，因而gus基因被广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在基因外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用得最多。 分光光度测定法 对硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG） 荧光测定法 4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG） 组织化学染色定位法 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc） 对应的检测方法 常用于gus基因检测的底物 荧光素酶基因的检测 用作报告基因的荧光素酶主要来自细菌或萤火虫。 萤火虫荧光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类，在Mg2+、ATP及O2作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化荧光素，其发射光子后转变成常态的氧化荧光素，反应中化学能转变成