第九章液相解析：.ppt

常见色谱故障3－压力波动 可能原因 －溶剂进口过滤芯堵塞 －溶剂未脱气 －泵的密封圈老化 －出口单向阀失效 －泵内有气泡 第五节 日常使用及维护 色谱柱 进样阀 流 动 相 检测器 高压泵 脱气装置 1. 高压泵的保养 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 2. 色谱柱维护 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相，控制流动相pH； 防止流动相互不相溶而使盐在色谱柱中析出； 严格控制进样量； 实验完毕，选用适当溶剂清洗柱子（无缓冲盐，用90%甲醇水溶液；含缓冲盐，用10%甲醇水溶液冲洗20 BV，然后再用90%甲醇水溶液冲洗20BV） 加保护柱； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 若色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相） 3. 检测器的保养 分析完成后，马上关闭检测器； 检测池污染时，将柱拆下，用合适的溶剂冲洗污染物。 冲洗色谱柱时应该断开与检测器的连接！ 4. 样品 滤膜过滤； 如样品提取自复杂物质（如动植物基质），最好对提取液进行适当的纯化处理（如SPE）； 最好用流动相或是弱于流动相(更少的有机相)来配制样品，这样能够得到好的峰形和灵敏度. 流动相 有机相为色谱纯级别，水相最好是超纯水或双蒸水； 过滤；脱气 普通色谱柱pH适用范围: pH 2~8; 确保流动相不同溶剂间的良好互容；对于有机溶剂-缓冲盐体系，确保缓冲盐不析出； 有机溶剂流动相: 室温下密封, 避光 缓冲盐流动相: 当日现配现用 低温下密封保存 选用适宜的容器　 2 星期 1 天 1 星期 1 小时 新鲜配制 5 10 15 20 25 0 分 测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm 保存于聚乙烯瓶中的超纯水 * * * * * * * 分离类型选择总结，P93 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小) 选择原则： 正相键合色谱：中等极性溶剂（酯或醚）； 反相键合色谱：极性溶剂（甲醇、乙腈、水）； 离子交换色谱：缓冲溶液； 凝胶色谱：极性溶剂或水； 复杂组分：混合溶剂或梯度洗脱 、 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据 ２. 流动相选择 纯度高（过滤，脱气）； 避免使用引起柱效损失或保留特性变化的溶剂； 与固定液不反应； 适宜的溶解度； 粘度小； 与检测器匹配。 对流动相的要求： 极性 结构 特征 物理特征 综合 3. HPLC首选方法建立 分离条件 较好的首要选择 色谱柱 尺寸（长度，内径） 150 ×4.6 mm 粒度 5μm 固定相 C18或C8 流动相 溶剂A和B 缓冲液-乙腈 % B 80~100% 流速 1.5~2 mL/min 温度 35~45℃ （或室温） 样品大小 体积 25μL 重量 100μg 初步分离结果 五、优化分离条件 分析条件的优化 1. 流动相的调整（种类与配比） 2. 梯度洗脱 3. 流速 4. 色谱柱粒径、长度 5. 温度 6. 检测器 流动相调整的规则 合适的保留因子k (k值1-20)是获得满意分离的基础 保留因子 k=(tR-tM)/tM 用以下“秘诀”可以使开发过程更加简便、快速 流动相的调整“秘诀” 秘诀1 由强到弱 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验， 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。 流动相的调整“秘诀” 秘诀2 三倍规则 每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 秘诀3 粗调转微调 当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。 流动相的调整“秘诀” 流动相的调整“秘诀” 秘诀4 更换