第五章蛋白质组研究方法要点分析.ppt

IPG胶-胶内酶切-串联质谱 Virtual 2-D (1) Gel 组成： T= a + b / m x 100 (%) C= b / a + b x 100 (%) T- 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺浓度% C- 甲叉双丙烯酰胺浓度%：一般3% a- 丙烯酰胺质量g b- 甲叉双丙烯酰胺质量g 第一维：等电聚焦 isoelectric focusing, IEF 原理： 蛋白质的等电点pI： 某一溶液中蛋白质静电荷为零的pH值。 分辩率高：0.01pH单位（精确度和重复性）。高度浓缩，可一次实验测出等电点。 蛋白质所处环境的pH值与其等电点不符，则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷。 在强电场中，带电的蛋白质分子会向正极或负极漂移，当达到其等电点位置时，蛋白不带电，就不再漂移。 连续分布的pH值被固相化在一维干胶条上，当蛋白质样本进胶条后，在强电场下按等电点不同分离蛋白质。 等电聚焦 等电点方向分离 a) 胶条和IPG缓冲液 c) 去除IPG胶保护膜 b) 加入样品和重泡胀液 d) 放入胶条，铺展样品 e) 用覆盖油封胶 f) 封闭持胶槽 g) 转移持胶槽 h) 编程并运行 一维等电聚焦操作流程 等电聚焦：结果 pH3 pH10 BIO-RAD公司PROTEAN IEF 一维等电聚焦仪 Amersham Bioscience 公司IPGphor 等电聚焦胶条的规格 注意问题 了解所要检测的样品离子浓度，可溶性，溶液体系 准备使用的重泡胀液类型及体积 胶条pH值范围的选择及相应的两性电解质选择 避免外来污染 IEF的优点： 1、分辨度高：0.01pH 2、样品体积和加样位置不严格 3、测定蛋白质pI 4、分离快，薄层IEF：2h 5、可保持原有蛋白的生物活性 IEF的缺点： 1、pI 附近会产生沉淀，影响分离效果 2、样品要不含盐 3、两性电解质可与蛋白质结合，使抗体反应、酶活性降低。 第二维： 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 S M N Vero Vero SARS SARS Marker 94,000 67,000 43,000 30,000 20,100 14,400 SARS攻击Vero E6细胞系病毒结构蛋白质鉴定结果 一维胶条平衡 目的：1.打开链内及链间二硫键，并封闭自由巯基 2. SDS和蛋白质以质量比1.4：1结合，使亚基表面携带过量负电荷，在电场中向正极移动 SDS+ 一维胶条 分子量标准 琼脂糖封胶 SDS胶类型 浓度分布 梯度胶，连续胶 制胶方式 自制胶，预制胶 电泳方向 水平胶，垂直胶 Bio-Rad Protean II xi Cell 二向分析系统 水平电泳仪Multiphor II及其附件 Ettan DALT II 二向分析系统 SDS胶染色 染色槽 双向电泳蛋白质检测方法 pI4-7L 94kd 14kd 二维电泳凝胶图谱 ImageScanner图像扫描系统 20 ′ 20 cm in 40 sec(at 300 dpi) Transmission and reflection mode 0.00 to 3.4 O.D. Scan color selection 14 bits / pixel (grey) Linked to ImageMaster Typhoon Multi-color fluorescence Phosphor-imaging Chemiluminescence 二维电泳新技术 Zoom Gel (放大胶)窄范围等电聚焦，提高双向电泳分辨率 差示荧光电泳（DIGE）保证二维电泳重现性 虚拟2-DE技术 4 6 9 11 3 10 7 6 Zoom gel 技术 22周龄胎肝 2-DE 图谱 3 10 4.5 5.5 4.5 5.5 4 6 6.5 5 窄范围胶条双向电泳图谱 表达谱构建(蛋白质点数) 1454 1665+1366=3031 1113+1973+1035+1366=5487 IPG 3-10 4-7 6-11 4-5 5-6 5.5-6.7 4.5-5.5 6-9 胶内差示荧光技术（DIGE） * * 第三章 蛋白质 组研究方法概论 一、三大基本技术 三大基本技术的功能： 1D、2D电泳（色谱）技术分离