第五章第二三节凝胶过滤与高效液相色谱要点分析.ppt

凝 胶 优点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等特点。适用于：a.分离纯化蛋白质(包括酶类)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质b.测定蛋白质的分子量c.样品的浓缩和脱盐等方面。 一、凝胶的分类及性质 性质： 凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好的分子筛功能。 分类： 葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶(生物胶)和交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚的凝胶等。 （一） 葡聚糖凝胶 商品名：Sephadex，它是由葡聚糖[右旋糖酐(G型)；和3-氯-1,2-环氧丙烷（交联剂)以醚链相互交联而成的。在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。 1．理化性质 葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见其表面的网状皱纹。它带有大量的羟基，亲水性好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。不同型号的葡聚糖凝胶的交联度(交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数)不同，使其在水中的膨胀度(床体积)、吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量)、筛孔的大小和分组范围有明显的差异。 例如，Sephadex G-25比G-100交联度大。而膨胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者。另外，前者对球形蛋白质的分级范围较窄，即在1000(下限)-5000(上限)之间，而后者的分级范围较宽，即在4000-150000之间。 本质： 葡聚糖凝胶置盐溶液或清洁剂中引起的膨胀程度并不影响样品的分级效果。但盐溶液或清洁剂能改变分离物质的结构时，则会影响分级效果。葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不同。 2．稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中稳定，不溶解，很少产生化学降解。在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒30分钟，其性质并不改变。在0.1mol/L HCl溶液中浸泡1-2小时，甚至在0.02mol/L HCl溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。  3．吸附性 葡聚糖凝胶系弱酸性物质,由于其每克干胶中含10-20微克当量的羧基基团所致。该基团能与分离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。但这种吸附作用可用提高洗脱液的离子强度解决。当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。因此葡聚糖凝胶层析时,常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。 新葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附力了。虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响。 此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附原理，而不是排阻原理。 （二）琼脂糖凝胶 琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典称Sepharose,美国称Bio-gel A；英国称Segavac；丹麦Gelarose,我国的同类产品与瑞典相同，这些琼脂糖中除Segavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售。 琼脂糖凝胶按其浓度分：Sepharose 2B(2％浓度)、4B(4％)和6B(6％)。Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。 琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。 （三）聚丙烯酰胺凝胶 商品名Bio-gel。是以甲撑双丙烯酰胺（双体）作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有Bio-gel P-2到P-300。 一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。特点：不溶于水和普通有机溶剂，能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡：在pH l-10或短时问超过此pH值的溶液中较稳定；要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分解（高温条件）。缺点：对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可以克服 （四） Sephacryl Sephacryl由烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺被共价交联制成的。属硬性凝胶，具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。Sephacryl吸水时，其珠状颗粒直径平均值为70μm。通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。 Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸，多糖和蛋白聚糖(Proteoglycans)。也可用硕大的病毒颗粒(直径?300-400) 的分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。 二、基本原理 凝胶过滤层析的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完