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分子荧光光谱法Molecular Fluorescence Spectroscopy Contents 分子荧光法的基本原理 1 荧光分析仪器 2 分子荧光定量分析及应用 3 分子荧光法的基本原理 1 产生 荧光光谱产生具备的条件 特点 分子荧光光谱法的特点 灵敏度高 选择性好 实验方法简单 待测样品用量少 不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长。比较容易排除其它物质的干扰，选择性好 。 具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、环境分析等领域 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁产生荧光。 光照激发 去激发光 ?* ? ? ?* ?n 基 态 荧光光谱的产生 基态分子 价电子跃迁到激发态 基态分子 价电子跃迁到激发态 基态分子 价电子跃迁到激发态 去激发光 ?* ? ? ?* ?n 基态分子 价电子跃迁到激发态 去激发光 ?* ? ? ?* ?n 基态分子 价电子跃迁到激发态 去激发光 ?* ? ? ?* ?n 基态分子 价电子跃迁到激发态 基 态 去激发光 ?* ? ? ?* ?n 基态分子 价电子跃迁到激发态 基 态 去激发光 ?* ? ? ?* ?n 基态分子 价电子跃迁到激发态 基 态 去激发光 ?* ? ? ?* ?n 基态分子 价电子跃迁到激发态 分子荧光光谱产生过程示意图 l 2 l 1 l 3 l ?2 S1 T1 系间跨越 内转换 振动弛豫 S2 S0 能 量 T2 内转换 发 射 荧 光 发 射 磷 光 外转换 振动弛豫 荧光激发光谱和荧光发射光谱 任何荧光化合物都具有两种特征光谱： （1）荧光（发射）光谱：固定激发光的波长，测量不同荧光波长处荧光的强度，得到荧光光谱，即荧光强度—荧光波长图。 （2）荧光激发光谱（荧光物质的吸收光谱）：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，得到荧光激发光谱。即荧光强度-激发光波长图。 200 250 300 350 400 450 500 nm 荧光激发光谱 荧光光谱 蒽的激发光谱和荧光光谱 荧 光 强 度 分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性的体系才会产生荧光现象。 电子跃迁类型 ?* → ?的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。 共轭效应 含有?* → ?跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光。 （2）具有一定的荧光量子产率。 测量荧光的仪器主要由四个部分组成： 激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 I0 I F 荧光分析仪器 2 光源： 最常用的是高压汞蒸气灯、高压氙灯、激光光源。 检测器：光电倍增管。 样品池：采用低荧光材料，通常为石英池。 单色器：第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2 ，与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。 荧光强度与浓度的关系 Lambert-Beer 定律： ①标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。 ②比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，再进行比较。 分子荧光的分析及应用 3 （一） 分子荧光定量分析 ③荧光猝灭法 把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性 若荧光物质 M 与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基态配合物MQ 常数 猝灭剂浓度 猝灭剂加入前 的荧光强度 猝灭剂加入后试 液的荧光强度 I前/I后与C（Q）有线性关系，可求猝灭剂含量 与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂 Q ，配成一个荧光物质—猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它们的荧光强度，得一曲线 I前/I后x CQx CQ 三 激发光波长λ1 和λ2的选择： （1）首先，在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意选择几个）对荧光物质进行荧光发射光谱的扫描，从而确定产生最大