信号转导研究方法_图文.ppt

PVDF膜 Activation of PPAR mediates curcumin suppression of the gene expression of EGFR in Moser cells. To study the effect of curcumin on the expression of EGFR and to elucidate the underlying mechanism, preconfluent Moser cells were pretreated with or without PD-68235 (10 μM) for 30 min before addition of curcumin at indicated concentrations for an additional 8 h. Whole cell protein extracts were prepared for Western blot analyses. β-Actin was used as an internal control for equal protein loading. * 免疫标记技术（immunolabelling technique）乃用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。 4．化学发光免疫分析 将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。 * * ProteinG-Sepharose * RNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光 RNase protection assay (RPA) Sensitive and quantitative alternative to Northern blots for the measurement of gene expression levels. Labelled antisense cRNA is transcribed from a DNA clone in an appropriate vector, hybridized with an mRNA sample, and single stranded RNA digested away with RNase, then run out on a gel. The amount of labelled RNA surviving is directly proportional to the amount of target mRNA present in the sample. 萤火虫荧光素酶(firefly luciferase) (Luc) 荧光素酶可以催化荧光素luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光。然后通过荧光测定仪(luminometer)或液闪测定仪就可以测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在luciferase的上游或其他适当的地方，构建报告基因质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。 内参基因：通常是管家基因，很少变化。 长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的Ｄｉｃｅｒ核酸酶切成２１～２３个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA 小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体，该复合体可识别与小干扰RNA有同源序列的ｍRNA，并在特异的位点将该ｍRNA切断。 转基因： 1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，