抗体工程要点分析.pptVIP

2 鼠单抗可变区的人源化 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。 经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体） 人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。 全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。 定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。 研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。 小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。 小分子抗体有很多优点: 可以用细菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。 3 小分子抗体 Fv ScFv 单区抗体 最小识别单位 Fab 由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。 (1)Fab Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。 (2)Fv 或 ScFv Fv ScFv 连接肽 Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。 在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。 单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法; 在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中; 如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。 单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式: 一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性; 二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。 即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。 (3)单域抗体 VH 约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。 (4)最小识别单位 CDR * 周俊宜 基础医学院生化教研室 概 述 抗体攻击病毒 凝集细菌 抗 SARS 的单抗 SARS-CoV 抗体 是对其抗原有极强专一性 的 魔弹 或 巡弋飞弹 研 究 以免疫转印法检测 特定抗原 医 疗 以毒素连结抗体攻击 病变細胞 检 验 以 ELISA 侦测特定 病原体 抗体药物销售趋势图 生物技术 生物技术制药 基因工程药物（蛋白类药物） 人源化治疗性单克隆抗体药物 基因治疗技术 现代中药 ● 至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种。 ● 2003年治疗用单抗销售总额已超过52亿美元。 ● 2006年预计50-60个治疗性单抗上市。 ● 2010年预计单抗销售额200亿美元。 ● 美国已占全球单抗市场90%—一支独秀。 ● 完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段 Epitope, Antigenic determinant 抗原決定基 ● 一个抗原分子上可能有数个抗原決定基 ● 每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗体