狂犬病病毒-分子生物学基础要点分析.pptVIP

RV的复制和转录 RV基因转录vs复制 两种状态的RNA聚合酶：RNA转录酶和RNA复制酶。 RNA转录酶：L、P、EF-1αβγ、Hsp60、GT（鸟苷转移酶），从N基因处直接开始转录。 RNA复制酶：L、P、可溶性的N蛋白（N-P复合物形式存在，为复制必须），从基因组的第一个bp处开始合成leader RNA和复制基因组。 RV基因的转录 转录重要的顺式作用元件：启动子、转录起始位点和转录终止信号。 RV基因转录调控模式：stop-start model。 RV基因组仅有一个启动子，5个基因有相同的转录起始位点：UUGU和转录终止信号：A/UCUUUUUUU。 通用模式：-间隔区UUGU---ORF---A/UCUUUUUUU间隔区。 RV转录元件 Stop-start model 一个基因转录的终止是下一个基因转录起始必须的。 RNA聚合酶在终止上一个基因转录时，大约有30%的RNA聚合酶不能起始下游基因的转录，造成转录依次递减30%。 研究发现，-ssRNA基因表达的调控主要是通过基因与3’端启动子的位置来控制的。 RV基因组的复制 3’leader和5’trailer互补链均含有复制起始信号，但5’的trailer互补链的复制信号强度大于3’ leader，造成-ssRNA：+ssRNA=50:1，因此包装成熟的病毒粒子含有-ssRNA与含有+ssRNA的比例也约为50:1 VSV转录和复制模型 病毒粒子的装配 研究发现，RV的基因组两端不存在特定的包装信号，-ssRNA或+ssRNA包装入病毒粒子完全由两种RNA在细胞内的丰度决定(Finker et al., 1997)。 然而，对VSV的研究发现，VSV基因组-ssRNA 5’端的trailer区含有包装信号，使-ssRNA被选择性包装入核衣壳 (Whelan and Wertz , 1999)。 G 蛋白简介 狂犬病病毒G蛋白参与病毒的组织趋向性和致病性，是主要的保护性抗原，负责诱导病毒中和抗体的产生。 整个G蛋白分为四个结构域：信号肽(signal peptite, SP)膜外区(ectodomain, ECTO)，跨膜区(transmembrane region, TM)和膜内区 (endodomain, ENDO)，成熟的G蛋白包括后面三个结构域。 G 全长: 522-533 aa 成熟G蛋白: 503-514 aa SP: 19 aa, TM: 22 aa, ECTO: 439 aa, ENDO: 42-53 aa RV G蛋白主要抗原位点 膜 34-42 198-200 II 膜外区：1-439 aa I 231 IV 264 III 330-357 a 342-343 244-281 G5 跨膜区：440-460 aa 膜内区：462-505 aa 反向遗传学技术 经典遗传学技术 Gregor Johann Mendel 1822 -1884 1 ： 1 表型（phenotype） 基因型（genotype） 反向遗传学技术 表型（phenotype） 基因型（genotype） 基因重组技术 -ssRNA反向遗传学建立的基础 L、P、N和病毒-ssRNA或+ssRNA包装形成核糖核蛋白复合体( ribonucleoprotein, RNP)。 RNP负责病毒进入细胞后的所有复制过程，包括病毒基因的转录和基因组的复制等。 体外构建具有活性的病毒单位必须提供：1.病毒-ssRNA或+ssRNA；2.L、P和N三种蛋白。 病毒-ssRNA或+ssRNA的提供： 提取病毒基因组 反转录得到cDNA 插入合适的载体 转入细胞，在外源提供RNA聚合酶的情况下转录出全长的-ssRNA或+ssRNA。 病毒三种蛋白的提供： 提取病毒基因组 分别克隆相应的基因 插入合适的载体 转入细胞，表达出相应的蛋白。 -ssRNA or +ssRNA？ 3’ 5’ RV ss (-) RNA genome RT 3’ 5’ PCR 3’ 5’ 3’ 5’ dsDNA 转录 3’ 5’ mRNA 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ antigenome (+) genome (-) 蛋白翻译 威尔金斯 * 值得注意的是，这七个GT狂犬病病毒属中，其宿主范围最广的是蝙蝠，7个GT都从蝙蝠上分离到，2-7几乎都是从蝙蝠身上分离 * * 狂犬病病毒分子生物学基础 狂犬病（Rabies） 俗称“疯狗病”，是由狂犬病病毒引起的一种接触性传染病，呈世界性流行，死亡率几乎为100%。 每年造成超过55,000人死亡，其中99%在亚洲，印度具首位，中国