实验九POD同工酶的提取分离活性测定教案解析.ppt

实 验 四 过氧化物酶同工酶的提取、分离 一、实验目的： 1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法； 2、掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原理及方法。 3、了解过氧化物酶(POD)的生物学功能。 二、实验原理: 1、过氧化物酶： 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。 二、实验原理: 2、同工酶概念： 同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如POD在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。 (1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 (2)影响电泳效果的因素： ①带电颗粒的大小和形状： 颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； ②颗粒的电荷数： 电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； ③溶液的粘度： 粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种： ①化学法 ②光聚合法 ①化学聚合： 引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶； ②光聚合： 催化剂是核黄素（VB2），在痕量氧存在下，核黄素光解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起； 链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质； 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用； 长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶； 该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。 （1）凝胶度： 是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂 （Bis）的总克数，用T%表示。 （2）交联度： 是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的 百分数，用C%表示。 一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。  聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T(总百分浓度)和C(交联百分浓度)。  第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。 第二、不连续系统中的三种物理效应： ①电荷效应： ②分子筛效应: ③浓缩效应: 以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为： 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．?材料：小麦幼苗 2．?仪器： （1）分光光度计； （2）移液管 （3）离心机（4 000r/min）； （4）研钵 (5)垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (6)稳流稳压电泳仪； （7）高速冷冻离心机； （8）电子天平； （9）电冰箱； （10）瓷盘、微量进样器； （11）电热恒温水浴锅； （12） S-22pC可见分光光度计；（13）电炉等 3、试剂： （1）1N HCl：用12N的浓盐酸来配制； （2）分离胶缓冲液（pH8.9的Tris-HCl缓冲液）： （3）浓缩胶缓冲液