第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选要点分析.pptVIP

* * 第六章 目的基因导入受体细胞及重组子的筛选 第一节 受体细胞 受体细胞（receptor cell）：又称宿主细胞或寄主细胞（host cell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。 1.受体细胞的概念 2.受体细胞选择所应遵循的原则 便于重组DNA分子导入。 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。（如：限制性内切酶缺陷型，避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。） 便于重组体的筛选。（选择与载体所含的选择标记相匹配的受体细胞基因型） 遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。 选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。 受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。 3.各种类型受体细胞的优缺点 （1）原核细胞 ■优点 大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。 ■缺点 由于原核细胞缺乏真核生物具有的RNA转录后加工、修饰系统、蛋白质翻译后加工、修饰、折叠复性系统，使某些真核细胞中编码蛋白的基因不能够在原核细胞中表达，甚至即使获得了表达，也不具有正常的生物学活性。 ■常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。 大肠杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。 细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原 反映。目前已实现商品化的基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌工程菌生产的。 枯草杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。能将基因 表达产物分泌到培养基中，不产生内毒素，具有芽孢行成能力，易于保存和培养。 蓝藻：是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达的宿主。 （2）真菌细胞 真菌是低等的真核生物，基因结构简单，基因表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此可用于表达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。 （3）植物细胞 优点：植物细胞具有全能性，一个细胞就能分化成一株完整的植株，这就意味着一个获得外源基因的植物细胞就能培养成稳定遗传的转基因植物。 缺点：具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。 方法：（a）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。 （b）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等。 （4）动物细胞 ■优点： 动物细胞具有RNA的转录后的剪接、加工机制，蛋白质翻译后的加工、修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。 易被重组质粒DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性。 可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。 ■缺点： 不能通过一个细胞的培养获得转基因动物。在获得转基因细胞后，需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。 第二节 重组DNA分子导入受体细胞 1.重组DNA分子导入原核细胞 （1）重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 ■转化（transformation)：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。 ■转化的方法 制备感受态细胞法 感受态细胞：处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。 制备感受态大肠杆菌一般利用CaCl2处理。 电穿孔转化法 其基本原理是利用电穿孔仪的高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间的通道，从而促进外源DNA的有效吸收。转化效率受电场强度、脉冲时间和外源DNA浓度的影响。 三亲本杂交接合转化大肠杆菌 ■转化率的计算及其影响因素 转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。 转化率 = 转化子数 / DNA分子数 （10-5表示105个DNA分子获 得一个转化子） 或 转化子数 / DNA质量（106/μg表示1 μg DNA分子得106个转化子） 影响转化率的因素 a：重组DNA分子的大小、构型、浓度、纯度及载体与受体细胞的亲和性。 b：菌株类型 c：转化方法：电穿孔法最高，CaCl2诱导法居中，三亲本杂交接合法最低。 （2）重组λ嗜菌体DNA分子转导大肠杆菌 ■转染（transfection）及转导（transduction