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SSR标记 —崔朝宇 SSR标记的简介及原理 SSR标记的步骤及分析 SSR标记引物设计 SSR标记 1 2 3 SSR （simple sequence repeat） SSR标记 简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200 bp以下 SSR标记是一种通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内在的核苷酸排布及其外在状态表现规律的技术 SSR标记的简介 SSR分子标记的分子学基础 微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。在植物中通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的 常见的二核苷酸重复单位：（AC)n、（GA)n、（AT)n 常见的三核苷酸重复单位： （AAG)n、（AAT)n SSR分子标记的分子学基础 微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展了SSR标记 SSR分子标记原理 根据两端序列的保守性，设计引物；进行PCR，电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成功鉴定的目的。 简而言之，就是通过对样本DNA多态性的分析，从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调控和差异。 SSR标记原理示意图 SSR分子标记的优势 SSR在真核生物基因组中分布广 多态性丰富 其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨率高、遗传信息量大 SSR通常为显性标记，呈孟德尔式遗传 具有很好的稳定性和多态性 DNA用量少 技术要求低，成本低廉 PCR扩增的可重复性高 SSR分子标记的劣势 开发和合成新的SSR引物投入高、难度大 现有的SSR标记数量有限，不能标记所有的功能基因 SSR多态性的检测和应用很大程度上依赖PCR扩增的效果 SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。 SSR分子标记的步骤 第一步：DNA 提取： 第二步：PCR : PCR体系（15微升）：45纳克模板DNA 2.25微摩尔/升引物 11.5毫摩尔/升 氯化镁 各625微摩尔/升 4种dNTP 10X PCR缓冲液 1.5U Taq DNA 聚合酶 PCR反应程序 ： 变性94 摄氏度 3min 30次循环：94摄氏度 25s ，50-60摄氏度 25s ，72摄氏度 45s 最后72摄氏度延伸 10min SSR分子标记的步骤 第三步：扩增产物电泳分离：一般用聚丙烯凝胶电泳或者特殊的琼脂糖凝胶检测扩增产物 第四步：染色： 一，银染 A，银染液的配制： 固定液(100mL冰乙酸加水稀释至1000mL)； 染色液(2gAgNO3、1．5mL37％甲醛，加水稀释至1000mL)；显色液(30gNa2CO3、1．5mL37％甲醛、0．2mLNa2S203，加水稀释至1000mL)终止液(10％冰乙酸)。 SSR分子标记的步骤 B，银染法操作：固定30min→去离子水洗涤5-10min→染色3Omin→去离子水洗涤2次(每次不超过30S)?→显色至所要程度→终止显影。 二，溴化乙锭(EB)染色： 将EB贮液(10mg·mL-1)用双蒸水稀释至 0．5μg·mL-1， EB染色操作：将电泳后的凝胶放人染色液中30min，染色后的凝胶放人蒸馏水中清洗5min，再将凝胶放人紫外凝胶成像仪观测结果。 SSR分子标记的步骤 第五步：结果分析 微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果 引物 设计 二 三 一 从有关数据库（GenBank, EMBL DDBJ等）或文章中查询 使用近缘种的引物 构建基因组文库,筛选SSR位点 SSR分子标记引物设计 构建基因组文库,筛选SSR位点 5锚定PCR 分离SSR标记 K可以跟任何核苷酸配对，V不能与A配对，