chapter亲和层析资料.ppt

* * * * * * 8.4.2 色素亲和吸附平衡 色素亲和吸附剂吸附蛋白质的机理较复杂 色素配基CB为一种生物模拟色素，具有特殊的化学结构，可以和多种蛋白通过不同机理结合。 CB分子的多个芳环使其具有一定疏水性，可以与蛋白质非极性表面发生疏水性相互作用；CB分子的发色基团具有与NAD+和NADP+相类似的构象和尺寸，可以与核苷酸依赖酶发生特异性结合；CB分子带有磺酸基，具有阳离子交换基的乡长，可以和蛋白质发生静电相互作用。 色素配基与载体介质有吸附作用，在高盐浓度下，两者间可发生强疏水性作用，造成色素配基倒伏，导致吸附容量下降 8.4 亲和吸附平衡 亲和层析包括进料吸附、清洗、洗脱和介质再生几个步骤。 吸附操作要保证吸附介质对目标产物有较高的吸附容量，杂质的非特异性吸附要控制在尽可能低的水平。一般杂质的非特异性吸附与其浓度、性质、载体材料、配基固定化的方法以及流动相的离子强度、pH和温度等因素有关。为了减小吸附操作中的非特异性吸附，所用的缓冲液的离子强度要适当，缓冲液的pH应使配基与目标产物及杂质的静电作用较小。 料液流速是影响层析速度和效果的重要因素。提高流速虽可加快分离速度，但会降低柱效。此外，琼脂糖容易受压变形，压力过大反而流速降低。 8.5 亲和色谱过程分析 清洗操作目的是洗去介质颗粒内部和颗粒间空隙中的杂质，一般使用与吸附时相同的缓冲液。 目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时，可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否复性。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱，以备下次使用。 8.5 亲和色谱过程分析 1） 层析前：制备亲和层析剂 选择 根据欲分离物质特性 配基 选择 根据配基分子大小及基团特性 载体 2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。 包括：非专一性洗脱和专一性洗脱 偶联 亲和层析剂 操作： 非专一性洗脱： 改变温度 改变pH值 改变离子强度 专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制 剂、底物类似物） 被吸附物质结合 竞争性地与 配体结合 Affinity chromatography Competitive elution 8.5.2 模型分析 基于线性推动力速率方程和恒定图式假设推算的总传质系数，预测穿透曲线的。 利用轴向扩散模型描述亲和色谱操作过程 如果亲和吸附平衡关系符合Freundlich等温式 假定恒定图式假设成立 利用简化的线性推动力速率方差表示固液相间的传质速率 8.5 亲和色谱过程分析 F 经过积分和转换得到公式 Kfa并非常数，而是浓度的函数，公式中用平均值表示，通过实测穿透曲线，利用公式可以计算Kfa平均值。 8.5 亲和色谱过程分析 亲和层析专一性高，操作条件温和，过程简单，纯化的倍数可达几千倍级，能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。亲和层析最初用于蛋白质特别是酶的分离和精制上，后来发展到大规模应用于酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离精制上。在生物化学领域，主要用于各种酶、辅酶、激素和免疫球蛋白等生物分子的分离分析。 8.6 亲和色谱的应用 1）纯化大分子物质 如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose 4B 2) 研究酶的结构与功能： 分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。 应用 8.6.1 t-PA的纯化—酶的抑制剂为亲和配基 8.6 亲和色谱的应用 8.6.2 干扰素的纯化—免疫亲和色谱 8.6 亲和色谱的应用 8.6.3 脱氢酶的纯化—色素亲和色谱 8.6 亲和色谱的应用 8.6.4 淀粉酶抑制剂的纯化—固定化金属离子亲