基因诊断与基因治疗资料.ppt

1、主要来自莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus，MoMLV）其中三个结构基因（gag、pol、env）被删除 2、标记基因（marker gene）插入空缺，供阳性选择用。如：新霉素抗性基因（neomycin resistant gene），该基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPTⅡ），能对抗新霉素（G418）。 3、有目的基因的插入位点 逆转录病毒载体的构建 逆转录病毒载体的优点 1.可插入足够长的外源DNA（7KB） 2.基因转移效率高，几达100% 3.重组体可整合入宿主染色体，并稳定表达和传代 4.宿主范围广、比较安全 缺点 1.只能整合入分裂活跃的细胞 2.靶细胞表面需要有特殊的受体 3.必须使用带有“辅助病毒”的包装细胞系 4.病毒滴度低 包装细胞：一种细胞，重组逆转录病毒载体只能在其中包装成没有感染能力的病毒颗粒，但能从中释放出去，这种细胞即包装细胞。 1.多数由各种辅助病毒转染小鼠成纤维细胞系 NTH3T3构成。 2.辅助病毒由MoMLV切除了病毒5’端LTR至Gag起始密码之间包装信号ψ等序列，虽能产生病毒蛋白但不能进行包装。 3.导入的逆转录病毒载体转录出的RNA可以利用辅助病毒产生的病毒蛋白包装成假病毒颗粒。 包装细胞系 （四）外源基因表达的筛选 在较多的表达载体中都有neor标记基因存在，若向培养基中加入药物G418，未被转化的细胞不存在neor标记基因，细胞不能存活，最后只有转化细胞存活下来。 （五） 回输体内 1.选择合适的疾病：单基因遗传病 2.具备该病分子缺陷的知识 3.有目的基因的克隆 4.克隆基因的有效表达 5.克隆基因的有效调节 6.可利用的动物模型 遗传病基因治疗的必要条件 四、基因治疗的应用 （一）遗传病的基因治疗 基因治疗的部分对象 1.严重联合免疫缺陷症（腺苷脱氨酶ADA缺乏） 2.囊性纤维变性 3.Gaucher病Ⅰ型（葡糖脑苷脂酶缺陷） 4.苯丙酮酸尿症（苯丙氨酸羟化酶缺陷） 5.血友病B（凝血Ⅸ因子缺陷） 6.家族性高胆固醇血症 7.地中海贫血 1.宿主的修饰：保护分裂旺盛的正常组织，如造血干细胞：导入二氢叶酸还原酶基因，获得对氨甲蝶呤的抗性 2.增强肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）活性： 如将肿瘤坏死因子（TNF）基因导入TIL。这是目前肿瘤基因治疗最常用的方法。 3.肿瘤细胞的修饰 （二）肿瘤的基因治疗 如： 自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体 药物前体 (无毒) Gene→酶→ ↓ 　　　　 药物复合物(有毒) 细胞死亡 例如： 单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞 HSV Gene-TK （在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达） Gene—TK GCV（胸苷类似物） TdR P p GCV---p 抑制DNA合成 脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应） （三）艾滋病的基因治疗 （四）心血管疾病、神经系统疾病等 其它领域中的应用 1、基因治