第二章发酵液的预处理和固液分离方法资料.ppt

一．超离心技术的原理 超离心技术中，由于使用的离心机类型是无孔转鼓，所以也属离心沉降，根据前面的讨论，粒子在离心力场中进行沉降的基本公式为： = （2-39） 如果粒子在离心力场中作匀速直线运动，即： = （2-40） 结合上两式并积分，便可求得在某种介质中，使一种球形粒子从液体的弯月面沉降到离心管某部(如底部)所需的时间: t = （2-41） t = （2-41） 式中t为沉降时间；μ为悬浮介质的黏度；d为粒子直径；ρs为粒子密度；ρ为介质密度；r1为从旋转轴中心到液体弯月面的距离；r2为从旋转轴中心到离心管底部的距离。 在某一转速时，沉降一组均匀的球形颗粒所需要的时间与它们直径的平方以及它们的密度和悬浮介质的密度之差成反比，而与介质的黏度成正比。 当粒子直径d和密度ρ0不同时，移动同样距离所需的时间不同，在同样的沉降时间，其沉降的位置也不同，这是“微分离心”的基础。 二．超离心技术的分类 按照处理要求和规模，超离心技术分为： 制备性超离心 分析性超离心 1．制备性超离心 制备性超离心的主要目的是最大限度地从样品中分离高纯度目标组分，进行深入的生物化学研究。 制备性超离心分离和纯化生物样品一般使用以下方法： 差速离心法 一般密度梯度离心法 等密度离心法 粒子差速离心 (Differential Pelleting) 差速离心法是采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降粒子，在不同离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。 (2) 一般密度梯度离心法 (Density gradient centrifugation) 也称分级区带离心，它是把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续分离区带。 该法仅用于分离有一定沉降系数差的粒子，与粒子密度无关。 (3) 等密度离心法 (Isopycnic Centrifugation) 当不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上(即等密度点)并形成区带，此即等密度离心法。 位于等密度点上的粒子没有运动，区带的形状和位置都不受离心时间的影响，体系处于动态平衡。 等密度离心的有效分离仅取决于粒子的密度差。密度差越大，分离效果越好，与粒子的大小和形状无关，但是此二者决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。 根据梯度产生的方式，等密度离心法又可分为： 预形成梯度(Preformed gradient) 自形成梯度(Self-formed gradient)的等密度离心，又称平衡等密度离心。 ① 预形成梯度等密度离心 需事先制备密度梯度，常用的梯度介质主要是非离子型的化合物(如蔗糖、甘油等)。 离心时把样品铺放在梯度介质的液面上，这个密度包括了所需要研究的密度范围，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才发生沉降，并排列成不同的区带。 ② 自形成梯度的等密度离心(平衡等密度离心) 平衡等密度离心常用的梯度介质有粒子型盐类如铯盐或铷盐和三碘化苯衍生物等。 离心时是把密度均一的介质溶液和样品混合后装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中进行再分配。 离心达到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度点的特定位置上，形成不同的区带。 粒子达到等密度点的时间与转速有关，提高转速可缩短平衡时间，延长时间可弥补转速不高的问题，一般离心所需的时间应以最小粒子达到平衡的时间为准。 2． 分析性超离心 分析性超离心技术主要用于研究纯的或基本上是纯的大分子或粒子(如核蛋白体)。 它只需要很少量的物质，并配备有光学分析系统，来连续地监测物质在离心力场中的行为，从这样的研究中得到的资料可以推断物质的纯度、相对分子质量和构象的变化。 (1) 相对分子质量的测定 借助于纹影光学系统和吸收扫描光学系统，用沉淀速度法可测定沉降系数S： S = （2-42） 式中 ω为角速度；r为粒子的瞬间旋转半径；t为时间。 利用沉降系数即沉降平衡法来测定相对分子质量： M = （2-43） 式中 M为分子量，R为气体常数，T为热力学温度，S为沉降系数，D为分子扩散系数， 为分子的部分