第九章-基因工程2014-5-515.4.11解读.pptVIP

目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。 五、基因工程的应用： ㈠、基因工程工业： 最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(1982)。 胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。 现已在细菌中生产10多种医药产品，如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。 细菌中生产胰岛素的方法： ⑴ 、双元载体(binary vectors) ：该系统具有两个质粒： ①. 用于克隆外源基因片段的克隆质粒：在E.coli和农杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，是一种穿梭质粒； 在T-DNA的LB、RB之间插入MCS及植物选择标记基因，在T-DNA序列之外 ，有细菌选择标记基因。 Ti质粒的衍生载体：构建了两套Ti质粒的衍生载体系统，广泛用于植物的遗传转化。 　②. 非致瘤Ti质粒没有T-DNA，它携带的毒性基因，其表达产物可以反式调控穿梭质粒T-DNA序列转移。　将两个质粒分别导入农杆菌中，由农杆菌介导克隆质粒当中的外源DNA转移到植物染色体中。 ⑵ 、共整合载体(cointergrated vectors)：　这个系统包括两个质粒，一个用作克隆外源基因的克隆质粒，另一个具有毒性基因(vir区)的非致瘤Ti质粒，但这两个质粒具有一段同源序列，在农杆菌中重组整合成一个载体，所以称为共整合载体。 过程：目的基因与启动子（花椰菜病毒35S）及终止子组成嵌合DNA分子?插入到克隆质粒RB与LB区间内构成重组质粒? 转化到农杆菌细胞? 重组农杆菌感染植物细胞? 质粒的部分DNA包括目的基因，整合到植物染色体，实现遗传转化。 根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早、最广泛的植物转化方法（双子叶植物、单子叶植物）。 农杆菌转化方法示意图： 壮观霉素 Spectinomycin 在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。 DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作和分析的大分子。 四、基因的分离与鉴定： 利用这一技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。 1.体外通过限制性内切酶的修剪和DNA连接酶的连接； 2.目标DNA分子 + 载体DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子。 DNA的体外重组 基因的分离与鉴定是DNA重组中的关键步骤之一。 分离的基因可用于基因的序列、结构分析与表达，又可为基因工程提供目的基因。 ㈠、从基因库中分离基因： 1 、基因库(gene library)的概念：　　是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。根据克隆核酸序列性质、来源，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA(complementary DNA)库、线粒体库等。 ①. 核基因库： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。 构建核基因库常采用能接受较大片段的载体： 使用λ或 柯斯质粒载体主要以分离结构基因为目的?方法：重组DNA包装进噬菌体，感染细菌后收集噬菌斑。 用于基因组作图分析多使用BAC或YAC载体?方法：重组人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基因库。 以噬菌体为载体构建核基因库示意图 构建完整核基因库所需克隆数的计算公式： N= ㏑(1 －P) ／ ㏑(1 －a/t) P 代表一个特定基因序列出现的概率. a 为插入载体中片段平均长度. t为基因组全序列长度. 例如：人类基因组DNA分子量为3.0 ×106 kb，以λ EMBL作载体，插入片段平均长度为17kb, P为99%时构建的基因库应该有8.1 ×105个噬菌斑。 ②. 染色体基因库： 将基因组的一部分如一条染色体用来构建基因库?可选择特异基因以及分析染色体结构和组织。 果蝇的多线染色体中，对染色体进行微切割,提取DNA并进行酶切后，克隆到载体上构建染色体区段基因文库。 人类基因组项目研究中，将中期染色体用两种可分别与A=T、G≡C结合的荧光染料标记，被标记的染色体流经激光束时发出荧光，光度计据荧光强度分拣出不同染色体。利用流动细胞分拣(flow cytometry)技术分离人类染色体并构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。 流式细胞分离原理 电子设备分析光电倍增器放大的荧光信号 带电荷的小液滴 分拣后的染色体 偏向板 充电圈 样品流 激光束 荧光积集透镜 酵母菌： 利用改