基因工程原理-第二章DNA重组资料.pptVIP

（一）依赖DNA的RNA聚合酶 SP6噬菌体RNA聚合酶 T4或T7噬菌体RNA聚合酶 种类 用途：制备cRNA探针 （二）依赖RNA的RNA聚合酶 五、DNA修饰酶 脱氧核糖核酸酶I：随机水解DNA双链或单链 核糖核酸酶：去除DNA制备物中RNA 外切核酸酶：从DNA或RNA链一端开始顺序催化水解3‘、5’－磷酸二酯键 末端脱氧核苷酸转移酶：末端加尾 碱性磷酸酯酶：催化分子脱5‘磷酸基 T4多聚核苷酸激酶：将ATP中γ－磷酸基转移到DNA或RNA分子5’－OH 甲基化酶： GATC G6mATC Dam甲基化酶 CC(A/T)GG C5mC(A/T)GG Dcm甲基化酶 大肠杆菌 6 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * DNA片段末端修饰后进行连接 DNA片段末端同聚物加尾后进行连接 粘性末端修饰成平末端后连接 DNA片段5’段磷酸化作用后连接 DNA片段末端同聚物加尾后进行连接 粘性末端修饰成平末端后连接 DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接 5 ——催化以DNA单链为模板，以4种脱氧核糖核苷酸为底物，合成一条与模板序列互补的DNA新链的酶。 三、DNA聚合酶 DNA聚合酶包括： 大肠杆菌DNA聚合酶I 大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶 T4 DNA聚合酶 T7 DNA聚合酶 修饰的T4 DNA聚合酶 逆转录酶 耐热性DNA聚合酶 （一）耐热性DNA聚合酶 1956年，美国Kornberg从大肠杆菌中分离出来。 由大肠杆菌基因polA编码， 单链多肽蛋白质。 分子量：109 kD 球形，Φ65埃 （二）大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coli DNA pol I） 1. DNA聚合酶I反应需要的条件: 全部4种脱氧核苷三磷酸,和Mg++. dATP dCTP dTTP dGTP 带有3’-OH游离基团的引物链. 2. DNA聚合酶I催化的反应 (1)聚合反应:5’→3’方向 DNA聚合酶I催化的聚合反应是在引物链3’-OH与dNTP分子的-P-基团间. dNTP接上后,又提供了1个3’-OH末端,继续连接dNTP分子. 合成方向是5’ →3’ DNA聚合酶I的聚合反应机理 引物 模板 PPi (2) 5’ →3’核酸外切酶活性: pol I pol I (3) 3’ →5’核酸外切酶活性: polI 3、DNA聚合酶I在基因工程中的应用 DNA缺口转移（nick translation）反应——用于分子克隆。 制备高比活的DNA探针。 DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活性 3’ 3’ 5’ 5’ nick 3’-OH 5’-P 缺口双链 DNA聚合酶I 的聚合活性 3’ 3’ 5’ 5’ nick 3’-OH 5’-P 切去1个5’核苷酸 在3’-OH上加上新的核苷酸 3’ 3’ 5’ 5’ nick 3’-OH 5’-P 32P标记的核苷酸 DNA缺口转移——线状分子 DNaseI切断DNA链 DNA聚合酶I 5’-3’核酸外切酶活性 DNA聚合酶I 的聚合活性 形成1条具有32P标记 的合成DNA链（标记探针） 在5’端切去1个核苷酸 切出1个缺口 在3’-OH加上1个32P标记的核苷酸 32P标记的核苷酸 制备高比活的DNA探针 25μl 1 μg纯化的目的基因DNA片段； 适量的DNaseI； DNA聚合酶； 32P-dNTPs；dNTPs； 典型的反应体系： （二）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA末端标记 Klenow聚合酶的特点： 分子量：76×103dal 具有聚合酶的活性 具有3’-5’的核酸外切酶的活性。 DNA聚合酶I MW：34×103 dal： 5’→3’核酸外切酶活性。 MW：76×103 dal：Klenow片段酶，保留DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。 枯草杆菌蛋白酶 Klenow聚合酶的应用： cDNA克隆中第二链合成的催化 补平双链DNA的3’凹端。 标记DNA片段的末端：带标记的dNTP DNA序列测定：Sanger末端终止法 cDNA的合成 第二链DNA 的合成 加SalI 衔接物 加EcoRI 衔接物 与pUC重组 cDNA克隆中第二链合成的催化 5’GATCT ? ? ?3’ 3’ A ? ? ?5’