基因工程-资料.ppt

* * * * * * * * * （一）借助载体上的遗传标志可快捷方便地进行筛选 1. 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子 将含有某种抗生素抗性基因的载体转入宿主细胞后，将细胞在含有相应抗生素的培养基中培养，无载体转入的细胞将被杀死，生长的细胞即是含有载体的细胞（转化子）。至于细胞中的载体是否为含有目的DNA的重组载体，尚需进一步鉴定。 2. 利用标志补救筛选带有载体的重组子 标志补救（marker rescue）是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，通过互补宿主细胞的相应缺陷而使细胞在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选带有载体的重组子。 3. 利用不同遗传标志可筛选出带有重组载体的克隆 （1）利用抗性基因的插入失活可筛选带有重组载体的克隆 诸多载体都带有抗生素抗性基因，当外源DNA插入某一抗性基因内，便可使该抗性基因失活。借助该抗性标志及载体上的其他标志，便可筛选出带有重组载体的克隆。 插入失活筛选带有重组载体的克隆 （2）利用抗性基因的插入表达也可筛选带有重组载体的克隆  例如：质粒pTR262携带来自λ噬菌体的CI基因，该基因在正常情况下表达产生阻遏蛋白，从而使tetR基因不能表达。当在CI基因中插入外源DNA后，将导致CI基因失活，从而使tetR基因去阻遏而表达。如果细菌内含有插入表达的重组体，则可在含有四环素的培养基上生长。 α-互补：pUC、pGEM及M13mp等载体系列均携带β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸残基（α片段）的编码序列，在该序列中含有多克隆位点；经过改造的宿主菌基因组DNA含有β-半乳糖苷酶C端（ω片段）的编码序列。只有当载体与宿主细胞同时共表达该酶的α和ω片段时，才能形成有活性的β-半乳糖苷酶，该现象称为α-互补（alpha complementation） 。 β-半乳糖苷酶可在诱导剂IPTG存在的情况下，使底物X-gal转变为蓝色产物，使细菌克隆或噬斑呈蓝色。当外源DNA片段插入载体的多克隆位点后，便不能表达α片段，转化细菌后不能分解底物，结果使菌落或噬斑呈现白色。因此，α-互补筛选又称蓝-白筛选 。 （3）α-互补筛选 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside α-互补筛选（蓝-白筛选） 4. 利用噬菌体的包装特性可初筛带有重组载体的克隆 λ噬菌体的一个重要遗传特性就是其在包装时对λ DNA大小有严格要求，只有重组λ DNA的长度达到其野生型长度的75%～105%时，方能包装形成有活性的噬菌体颗粒，进而在培养基上生长时呈现清晰的噬斑，而不含外源DNA的单一噬菌体载体DNA因其长度太小而不能被包装成有活性的噬菌体颗粒，故不能感染细菌形成噬斑。 （二）根据序列特异性可筛选出特定的重组DNA 根据序列特异性进行筛选的方法包括： 限制性核酸内切酶法 PCR法 核酸杂交法 DNA测序法等 酶切筛选 PCR筛选 3. 核酸杂交法常用于从文库中筛选目的DNA 常用方法是将转有外源DNA的菌落或噬斑影印到硝酸纤维膜上，细菌裂解后所释放出的DNA将吸附在膜上，将膜与标记的核酸探针杂交，通过检测探针的存在即可鉴定出含有重组DNA的克隆。该方法又称为菌落或噬斑原位杂交（in situ hybridizaiton）。根据核酸探针标记物的不同，可通过放射自显影、化学发光、酶作用于底物显色等方法来显示探针的存在位置（即阳性克隆的存在位置）。 菌落或噬斑原位杂交 Southern印迹（Southern Blot） 4. 核苷酸序列测定是最准确的鉴定目的DNA的方法 测定核苷酸序列的方法主要有双脱氧链末端终止法和化学降解法，尤其以前者最为常用。 针对已知序列，通过测序可明确序列和阅读框的正确性；针对未知序列，可明确序列顺序，为进一步研究提供依据。 DNA链末端终止法 DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸（或同一测序引物），然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果举例 （三）亲和筛选法借助相关表达产物而筛选阳性克隆 亲和筛选法的前提是重组DNA进入受体细胞后能够表达出其编码产物。 常用的亲和筛选法的原理是基于抗原-抗体反应或配体-受体反应。一般做法同