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* * * * * * * * * (一)借助载体上的遗传标志可快捷方便地进行筛选 1. 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子 将含有某种抗生素抗性基因的载体转入宿主细胞后,将细胞在含有相应抗生素的培养基中培养,无载体转入的细胞将被杀死,生长的细胞即是含有载体的细胞(转化子)。至于细胞中的载体是否为含有目的DNA的重组载体,尚需进一步鉴定。 2. 利用标志补救筛选带有载体的重组子 标志补救(marker rescue)是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时,通过互补宿主细胞的相应缺陷而使细胞在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选带有载体的重组子。 3. 利用不同遗传标志可筛选出带有重组载体的克隆 (1)利用抗性基因的插入失活可筛选带有重组载体的克隆 诸多载体都带有抗生素抗性基因,当外源DNA插入某一抗性基因内,便可使该抗性基因失活。借助该抗性标志及载体上的其他标志,便可筛选出带有重组载体的克隆。 插入失活筛选带有重组载体的克隆 (2)利用抗性基因的插入表达也可筛选带有重组载体的克隆 例如:质粒pTR262携带来自λ噬菌体的CI基因,该基因在正常情况下表达产生阻遏蛋白,从而使tetR基因不能表达。当在CI基因中插入外源DNA后,将导致CI基因失活,从而使tetR基因去阻遏而表达。如果细菌内含有插入表达的重组体,则可在含有四环素的培养基上生长。 α-互补:pUC、pGEM及M13mp等载体系列均携带β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸残基(α片段)的编码序列,在该序列中含有多克隆位点;经过改造的宿主菌基因组DNA含有β-半乳糖苷酶C端(ω片段)的编码序列。只有当载体与宿主细胞同时共表达该酶的α和ω片段时,才能形成有活性的β-半乳糖苷酶,该现象称为α-互补(alpha complementation) 。 β-半乳糖苷酶可在诱导剂IPTG存在的情况下,使底物X-gal转变为蓝色产物,使细菌克隆或噬斑呈蓝色。当外源DNA片段插入载体的多克隆位点后,便不能表达α片段,转化细菌后不能分解底物,结果使菌落或噬斑呈现白色。因此,α-互补筛选又称蓝-白筛选 。 (3)α-互补筛选 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside α-互补筛选(蓝-白筛选) 4. 利用噬菌体的包装特性可初筛带有重组载体的克隆 λ噬菌体的一个重要遗传特性就是其在包装时对λ DNA大小有严格要求,只有重组λ DNA的长度达到其野生型长度的75%~105%时,方能包装形成有活性的噬菌体颗粒,进而在培养基上生长时呈现清晰的噬斑,而不含外源DNA的单一噬菌体载体DNA因其长度太小而不能被包装成有活性的噬菌体颗粒,故不能感染细菌形成噬斑。 (二)根据序列特异性可筛选出特定的重组DNA 根据序列特异性进行筛选的方法包括: 限制性核酸内切酶法 PCR法 核酸杂交法 DNA测序法等 酶切筛选 PCR筛选 3. 核酸杂交法常用于从文库中筛选目的DNA 常用方法是将转有外源DNA的菌落或噬斑影印到硝酸纤维膜上,细菌裂解后所释放出的DNA将吸附在膜上,将膜与标记的核酸探针杂交,通过检测探针的存在即可鉴定出含有重组DNA的克隆。该方法又称为菌落或噬斑原位杂交(in situ hybridizaiton)。根据核酸探针标记物的不同,可通过放射自显影、化学发光、酶作用于底物显色等方法来显示探针的存在位置(即阳性克隆的存在位置)。 菌落或噬斑原位杂交 Southern印迹(Southern Blot) 4. 核苷酸序列测定是最准确的鉴定目的DNA的方法 测定核苷酸序列的方法主要有双脱氧链末端终止法和化学降解法,尤其以前者最为常用。 针对已知序列,通过测序可明确序列和阅读框的正确性;针对未知序列,可明确序列顺序,为进一步研究提供依据。 DNA链末端终止法 DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸(或同一测序引物),然后进行Sanger测序反应,反应产物经电泳(平板电泳或毛细管电泳)分离后,通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光,检测器采集荧光信号,并依此确定DNA碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果举例 (三)亲和筛选法借助相关表达产物而筛选阳性克隆 亲和筛选法的前提是重组DNA进入受体细胞后能够表达出其编码产物。 常用的亲和筛选法的原理是基于抗原-抗体反应或配体-受体反应。一般做法同
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