1993年诺贝尔化学奖.ppt

1993年诺贝尔化学奖Kary mullis PCR 技术 The method of polymerase chain reaction 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）一个非常简单，然而却是很有用的体外DNA聚合反应。PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，它可以使人们通过几个小时的试管内的DNA聚合反应，就可将DNA扩增109倍。通过PCR技术不仅可以扩增存在于样品中的DNA，也可以富集混合DNA分子中的任一种。PCR的重要价值在于扩增存在微量而特殊的DNA序列。 凯利·穆利斯（Kary Mullis 1944—）1944年12月28日出生于美国北卡罗来纳州的勒诺。穆利斯在南卡罗来纳州的一个小镇度过了童年，成长环境非常宽松，使他享有充分的自由和空间，这为他性格的形成提供了条件。 1962年他在佐治亚州理工学院学习化学，获学士学位；1966—1972在加州大学伯克利分校攻读生物化学博士学位；接着，先后在堪萨斯大学医学院和加州大学旧金山分校作博士后；1979年任职于Cetus公司，其间发明了PCR技术。 1986—1988年任Xytronyx公司分子生物学部主任。从1987年开始在加州任PCR技术与核酸化学的非官方顾问。他现在是加州奥克兰儿童医院和研究所的知名专家，并为几家公司作科学顾问。 19世纪50年代，Khorana合成了寡聚核苷酸，同时，他利用合成的寡聚核苷酸DNA合成酶以及DNA，开发出了使DNA扩增的方法。当时，这一领域的研究人员通常都使用Khorana的DNA扩增技术。可以说，这是一个司空见惯的基本技术，谁也没有去想过这种方法的不便之处。  1971年，Khorana曾提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… 因此，30年来没有人去改革这个方法，人人都满足于这个方法。就连Mullis本人在大学做基础研究时，也没有想到要去开发一种更简便的方法，以取代Khorana的方法。 1979年，穆利斯进入Cetus公司，从事合成寡聚核苷酸的工作。1981年他担任DNA合成实验室主任，主要任务是加速和优化寡聚核苷酸的合成。80年代初DNA合成仪进入实验室，他对这台原型机提出了许多改进的意见，还试着编写新的程序。由于DNA合成仪的应用使寡核苷酸的合成效率提高10倍。这样，穆利斯能把更多的时间用于计算机上。PCR的点子，也就是在这样的情况下诞生的。 1983年4月一个周末的晚上，他驾车与一位同事去乡村别墅在蜿蜒的乡间公路上开着车，，他思绪不断，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。他萌发了PCR的构想。 整个周末他都在思考着PCR问题，他想DNA合成起始于DNA解链，在一段寡核苷酸作为引物下，聚合酶沿着模板从引物的末端开始进行DNA的扩增，这需要人工加入核苷酸，这一过程在实验室可以实施。他还反复思考能否用两个引物来代替现行的单引物法？如果两个引物的大小不同，结果两条链的序列将同时被测定，而且互为印证；其次，他想能否分两次加入聚合酶，以防止新合成DNA的核苷酸易于脱落和被聚合酶错搭到新生链中的现象。 再有，经常使用计算机使他注意到了“循环”，他也想到DNA呈指数增长的趋势；最后他还想到扩增是否具有专一性的问题，因为在合成第一次反应中，人们无法终止聚合酶对引物的扩延。但穆利斯注意到在第二次及后续的链反应中，由第一次反应得到的那些“长反应产物”只能被扩延到另一引物与模板DNA相结合的部位，过了那个位点，扩延反应就无法进行了（没有模板）。所以PCR产物的长度是确定的。 他开始用人类神经生长因子作为目标序列进行扩增，没有结果。转而他选择PBR322质粒作为模板，实验中通过缩小反应体积来增加各成分的浓度，并将复性温度降低到32℃，减少每次加入的聚合酶的量，在10次循环后停止，结果他看到一条浅的带。接着，他又对方法进行了改进，增加几次循环，得到的带还是较浅。他又尝试用50kb碱基对的λ噬菌体做模板，用限制酶将模板降解为2000碱基对左右，扩增没有成功。他再次更换模板改用实验室合成的100碱基对的寡核苷酸作模板，对?珠蛋白基因进行扩增，结果得到扩增产物。这期间Cetus公司成立了PCR小组，经全体成员的共同努力，1984年11月，终于得到与预期分子完全符合的