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目 录 基因工程 (genetic engineering) 基本要求： 掌握基因克隆的基本工具 克隆基因的基本方法 能够设计一个基因克隆的程序 PCR技术基本原理和应用 一、基因工程的概述 三、基因工程的基本过程 二、基因工程相关概念 四、基因工程过程小结 五、基因工程的意义 六、目的基因的定点诱变及其应用 DNA重组？基因克隆?基因工程？ 生物技术？高新技术？ 一、基因工程的概述 1、基因工程理论上的三大发现 证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导） DNA的双螺旋结构和半保留复制机理 遗传信息的传递方式（中心法则） 2、基因工程技术上的三大发现 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始） 载体的使用 1970年，逆转录酶的发现。 3、基因工程的发展史 1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子; Cohen等获得了抗卡那霉素和抗四环素的重组菌落TcrNer，标志着基因工程的诞生。 1977年 美国南旧金山建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用基因工程技术生产胰岛素的工厂 1982年，培育出了超级鼠 转移了大鼠生成素基因的小鼠 1993 基因工程西红柿在美国上市(图) 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉 1999.9 中国负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 多聚半乳糖醛酸酶(PG)破坏 二、基因工程相关概念 （一） DNA克隆 1、克隆(clone)：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合或获取同一拷贝的过程 (cloning)。 2、DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子，replicon)，继而转入宿主细胞，筛选出含有目的基因的细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)。 3、基因工程(genetic engineering) ：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，对DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，实现受体生物的定向改造与改良。目的是分离获得某一感兴趣的基因或DNA或表达产物（蛋白质） （二）工具酶 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 一把特殊的剪刀----限制性内切酶的发现者阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖 1、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)：识别特异DNA序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 2、DNA连接酶 （三）目的基因 （四）基因载体（vector） 基因载体：携带目的基因的一些DNA分子。 克隆载体(cloning vector):使外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector) :使外源DNA序列转录翻译成多肽链而特意设计的载体 三、基因工程的基本过程 目的基因的制备 载体的选择和制备 DNA分子的体外连接 将外源DNA导入宿主细胞 目的基因的筛选和鉴定 目的基因的表达 （一）目的基因的获取 1、化学合成法 2、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 3、基因组DNA文库(genomic DNA library)、cDNA文库(cDNA library) （二）载体的选择和构建 1、载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物；有MCS（multiple cloning sites ）；分子量小，以容纳较大的外源DNA 2、常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA 质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会