真核表达系统的选择和高效表达策略资料.pptVIP

多拷贝转化子的筛选 通常增多转化子携带外源基因的拷贝数能够在一定程度上提高表达量,因此筛选出多拷贝转化子来提高产量是一个简单容易实施的策略。常用的方法是使用带有抗性标记的载体,通过工程菌对抗生素的耐受力的不同来进行多拷贝筛选,耐受抗生素浓度越高意味携带的拷贝越多。商业化的抗性标记有卡那霉素抗性基因(在酵母中耐受G418) ,细菌shble基因(在酵母中耐受Zeocin) 。此外还可以使用携带多拷贝表达盒的载体进行转化来获得多拷贝转化子。国外也有报导在大肠杆菌引入转座子,在大肠杆菌阶段利用抗生素浓度筛选携带多拷贝目的基因的质粒。 然而也有不少实验表明,拷贝数越多并不一定意味表达量越大,如果要确定多拷贝策略对提高特定目的基因产量是否有效,需要同时筛选出单拷贝载体与多拷贝载体并对两者进行产量对比才能得到影响结果。通常采取利用酵母转化子耐受的最高抗生素浓度的方法快速粗略判定拷贝的数目。 基因剂量 一般来说,高拷贝整合可以提高表达量, 如Jeffrey 等发现, 重组CD40L 的最高产量是在有8 个以上拷贝的菌株中获得。但许多实例表明,含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量。个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应,原因可能在于过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制。因此,高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准,基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋 白。 分泌信号 不适合的信号肽可导致信号肽加工不完全,或者蛋白分泌水平低,甚至不能分泌。尝试不同的信号肽,对信号肽进行突变改造或人工全合成信号肽等策略可用于实现信号肽正确加工和提高分泌水平。. 韦宇拓等利用菊粉酶的信号肽序列来构建巴斯德毕赤酵母分泌载体并表达了B2葡聚糖酶,结果表明ISP 信号肽序列分泌效率不低于利用α因子 信号肽的表达载体pPIC9 K。Singh 等通过定向缺 失诱变导致了含有天然N 端的成熟干扰素的正确 释放,可以成为解决这一问题的一种好方法。 　培养条件的优化 毕赤酵母可以通过不同整合方式得到三个表型,其中Mut+能够快速利用甲醇,MutS利用得慢,Mut-不能利用甲醇生长。表型的选择一般由需要表达的蛋白而决定。由于毕赤酵母可以高密度培养,外源蛋白对酵母没有特别影响时通常酵母密度越大蛋白分泌量越大,因此一般使用Mut+型的转化子,这样在甲醇的诱导下也能利用甲醇来增殖。也有个别例子是MutS型的蛋白分泌量较大,这可能是由于MutS 型在诱导阶段长得慢些,蛋白反而能够正确折叠加工,也有些是因为外源蛋白有细胞毒性,浓度高会对毕赤酵母生长有不良影响,产生反馈抑制。诱导表达时甲醇的用量为发酵液总体积的0.5%～3%之间,甲醇浓度太高将会产生毒性。可以采取一定时间内补加甲醇的措施,弥补消耗掉的甲醇。大量的资料表明诱导时间在3 d～5 d之间最好,时间再长对蛋白的表达通常没有什么帮助,因为前期分泌出来的蛋白有被降解的可能。 培养条件的优化 毕赤酵母表达外源产物最合适pH通常是3.0～8.0，温度在28℃～30℃之间,并且需要较快的摇瓶速度提供较多氧气和传递发酵产生的热量,同时接种量也需要控制在一定的范围。虽然酵母的菌体密度越大越好,表达量也相应的有一定提高,这也是毕赤酵母的突出优点,但菌体的密度同时会受到供氧和营养供给及蛋白降解等限制,需要通过实验来进行优化。 培养条件的优化 长时间的诱导表达,外源蛋白有可能被降解。在发酵罐大规模生产时,蛋白降解的影响更为严重,常需要采取不同的方法防止外源蛋白降解。一般有下面几种方法:使用蛋白缺陷型菌株(如SMD1168) ,减少蛋白水解酶的影响;在培养基中添加蛋白胨或者酪蛋白水解产物来抑制水解;利用酵母可以在较宽的pH下生长的特点尝试调节磷酸盐缓冲液的pH以抑制水解。此外调整培养基的配料如氮源、在添加甲醇前彻底去除甘油以减少表达抑制、糖基化的优化等措施都有相应例子实现蛋白产量的提高。 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 微生物基因工程 李刚 副教授 教学内容 一、PCR引物的设计与实验操作技巧；二、基因组文库的建立与筛选；三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中 的应用；四、原核表达系统的选择和高效表达策略； 五、真核表达系统的选择和高效表达策略。 五、真核表达系统的选择和高效表达策略 真核生物表达系统主要包括： 酵母表达系统、