非洲猪瘟pK205R技术报告.docVIP

非洲猪瘟pK205R、p54蛋白克隆、表达、纯化及其免疫学诊断方法的建立 研 究 生：刘文俊 导 师：孙怀昌 教授 专 业：预防兽医学 一、研究背景 二、目的及意义 三、技术路线 四、研究进展 五、后期研究工作 研究背景 非洲猪瘟ASF（African swine fever ） 非洲猪瘟病毒样病毒科唯一成员； 双股DNA 病毒，虽是DNA病毒，却是在细胞浆内增殖； 唯一一种DNA虫媒病毒； p54、pK205R蛋白抗原性较强，在ASF血清学诊断中有很高的灵敏性和特异性（均在90%以上）； p54（E183L）都能被IgG和IgM抗体反应所识别； 抗pK205R、p54的抗体在病毒感染早期就可以检测到，便于“早发现，早处理”！ ELP蛋白表达纯化系统 通过温度、盐离子浓度，PH改变，机械离心等，即可获得纯化蛋白。 经济，高效，易于操作！ 目的及意义 本病的症状和病变和猪的其他出血性疾病，特别是经典型猪瘟很难区分，而且没有疫苗可以使用，所以快速而准确的实验室诊断就显得尤为重要。 2个重要结构蛋白的表达纯化为ASF抗体检测和血清学诊断提供大量抗原。 pET-EI-K205R克隆的构建 pET-EI-E183L克隆的构建 Elp系统表达 纯化重组蛋白 构建pET-EI-K205R 和pET-EI-E183L 克隆 参照GENEBANK 发表序列设计引物 扩增K205R和 E183L基因 以两种重组蛋白 建立ASF的间接ELISA 以ASF阳性 和阴性血清为一抗 做Western blotting分析 SDS鉴定 pKSS-KIL载体的构建 已构建的 pET-EI-α-IFN克隆 α-IFN纯化产物 生物学活性检测 泳道1：K205R基因PCR产物 M：λ DNA/HindⅢ Marker 泳道1：E183L基因PCR产物 M：λ DNA/HindⅢ Marker 泳道1:pET-EI-K205R Sal I、BsrG I双酶切 M：λ DNA/HindⅢ Marker 泳道1：pET-EI-E183L Sal I、BsrG I双酶切 M：λ DNA/HindⅢ Marker pK205R的ELP纯化产物SDS图 p54的ELP纯化产物SDS图 Pkss-EI载体的构建 pET-EI载体准备 泳道1 ：pET-EI-GFP Nco I、Xba双酶切 M：λ DNA/HindⅢ Marker ELP表达纯化的α-IFN生物学活性观察 VSV TCID50的测定（karber法） 结果：TCID50=10-6.625/0. 1ml（24h）； 每孔加入含100个TCID50的VSV至96孔板，吸附1.5-2h,弃上清，细胞对照不加病毒液； 每孔加入100ul不同稀释度的α-IFN（10-1～10-12），病毒对照不加； 大约22h后观察细胞生长状况。