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影响Rf值的主要因素 展开剂的pH：弱酸和弱碱的离解受pH影响，离解度越大，极性越强，越易分配在极性强的一相；温度：温度变化会引起分配系数变化，也可能改变展开剂的组成；滤纸的性质：主要是厚度、均匀性、纸纤维的松紧程度以及无机离子含量的差异；展开距离：在相同的条件下，展开距离大，Rf值大；层析缸的饱和程度：未饱和时，Rf值可能增大；共存物质。 影响Rf值的主要因素 由于Rf值的影响因素较复杂，要得到重现性好的Rf值，需要严格控制实验条件。为了消除系统误差，有时在实际工作中，人们采用相对比移值Rst进行定性： 所采用的对照物可以是样品的一个组分，也可以是加入的外标，Rf值可大于1。 4.3 纸色谱的实验技术 　1） 层析滤纸的选择　　层析滤纸由高纯度的棉花制成，它与普通滤纸的差别在于滤纸的质量，包括杂质的含量。对滤纸总的要求是均匀、紧密、纯净。　　商品层析滤纸分为快速、中速、慢速；以及厚薄型等规格。中速薄型层析滤纸，如新华2#层析滤纸适合一般用途分离。　　滤纸的形状可以是长条、方形和圆形等。 2 ） 点样　　液体样品可直接点样。固体可溶解在适当的溶剂中，一般采用与展开剂极性相似的溶剂，大约配成1 %的浓度。　　点样量与层析纸的性能、厚薄、显色剂的灵敏度以及展开方式有关，一般点样体积在0.002-0.2 mL之间或几微克到几十微克之间。　　点样方式可采用玻璃毛细管或微量注射器进行。点样点距滤纸一端约2-4cm为宜，两点之间的距离约1-2cm。点样时斑点一般不应大于3mm。对于稀溶液，可以在溶剂挥发后再次点样。 3）展开　　展开剂 (development solvent) 的选择，对纸色谱分离来说是起决定作用的。应根据分离对象、溶剂的性质选择展开剂。通常采用二元或三元溶剂系统，以保证样品在展开剂中有一定的溶解度和足够的分离度。如分离氨基酸可采用正丁醇-醋酸-水（12：3；5）三元展开剂系统。　　纸色谱法展开必须在一密闭容器中进行。展开前，应先将溶剂置于容器内，使其为溶剂蒸气充分饱和。必要时，容器内壁应衬滤纸，以保持层析室的溶剂蒸气饱和。  展开方式 上行法：将滤纸上端挂起，下端浸入展开剂展开。  下行法：将滤纸上端折纹浸入展开剂中，向下方展开。 辐射法：展开剂由圆形滤纸中央向四周展开。 双向展开法：先后用两种不同的展开剂在垂直方向展开。 　4） 检出（显色）　　 　　纸色谱展开完毕后，应用笔画下展开剂前沿，并将滤纸风干。对无色物质需要显色确定组分斑点的位置。 通常采用特定的显色剂喷湿滤纸显色。 如茚三酮显色剂鉴别氨基酸； 硝酸氨银显色剂鉴别糖类物质； 亚铁氰化钾溶液鉴别某些金属离子等。 4.4 纸色谱法应用举例 　定性分析：一般采用标准物质同时展开，对照比移值。定性时要严格控制实验条件，选用不同的展开剂和展开方法，重复测定比移值。为了消除各种因素的影响，在实际工作中可采用相对比移值（Rst）定性 。　定量分析：纸色谱法一般只能达到半定量分析。可采用斑点目视法或斑点洗脱测量法。　斑点目视法：比较样品斑点和参考物斑点的面积大小和颜色深浅，估计其含量大小。　　纸色谱法不仅适用于分离水溶性或极性较大的有机物的分离和检出，也可以用于分离和检出无机化合物。 氨基酸分离 氨基酸的分离一般需用双向展开。 先用酚/水（7：3）展开剂做第一次展开；再用丁醇/醋酸/水（4：1：2）展开剂作第二次展开， 然后用茚三酮溶液显色，可分离出约20种氨基酸。 菠菜提取液的辐射纸色谱 5.5 薄层色谱 薄层色谱法（Thin layer chromatography, TLC） 是在纸色谱和柱色谱发展起来的一种微量分离技术。 它的操作方式类似于纸色谱。 但由于它的固定相多、分离效率高、检出灵敏度高以及分离过程快等优点，应用远比纸色谱广泛。 如反应终点控制、工艺条件选择、产品质量检验和未知试样剖析等，它也成为一些国家药典上的标准方法。 5.5.1 薄层色谱原理 薄层色谱法是把吸附剂均匀地涂布于玻璃板或塑料板上使之形成薄层（固定相），试液滴于薄层板的起始线上，待溶剂挥发后，放入盛有一定展开剂的展开室。 由于薄层的毛细管作用，展开剂沿着薄层板不断展开，样品中的各个组分就沿着薄层在固定相和流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的色谱分配过程。经过一段时间的展开，不同组分就在薄层上分开。 如果试样组分有颜色，就可以看到各个色斑。否则，应进一步显色，确定各个组分在薄层中的位置。  薄层色谱的毛细管作用: 由于薄层色谱的吸附剂颗粒很细，颗粒间狭窄通道类似于毛细管，因而和纸色