神经干细胞的研究现状与应用前景资料.pptVIP

（1）反复传代法：取3～4个月龄的人胚胎纹状体或孕 14～16天小鼠、大鼠胚胎大脑，机械分离制作单细胞悬液。在含多种神经因子的无血清培养基中培养，实现NSC的体外稳定有效扩增。经过长期培养反复传代可使NSC得到纯化。 （2）流式细胞术：Sasaki等采用流式细胞仪对约60种细胞表面抗原进行筛选，结果发现分选出的具有CD133+/CE34+/CD45-（细胞表面抗原）的细胞为NSC。 （3）基因转导：Keyoung 等利用腺病毒为载体,将置于归巢素和Msi1增强子和启动子控制下的绿色荧光蛋白基因导入人胚胎细胞,然后对胚胎细胞进行体外培养,只有NSC能特异性地出现绿色荧光蛋白。再利用流式细胞仪进行荧光筛选,能进一步将NSC收集起来。 （4）免疫磁珠细胞分选法：利用磁珠表面的特异性抗体与NSC表面抗原结合，在磁场作用下使结合磁珠的NSC与其他细胞分离，从而得到较纯化的NSC。 神经干细胞的分离与纯化 神经干细胞的鉴定 　　1990年，Lendahl的实验证实，神经干细胞的标志蛋白是神经上皮干细胞蛋白（nestin）．Nestin在神经胚形成时开始表达，随着神经细胞的迁移和分化的完成，Nestin的表达量逐渐下降甚至完全停止。目前，Nestin已被用于神经干细胞的鉴定。 培养的小鼠神经干细胞　　　　　　胚胎小鼠脑侧室　　　　　　　　胚胎小鼠纹状体 Sakakibara等人鉴定出一种RNA结合蛋白即 Musashi ,可作为NSC的标志物。 (Sakakibara et al. 1996) E10 E14 Ventricular zone of spinal cord m-Msi-1 nestin (Sakakibara et al. 1996) 　　对分离培养得到的NSC进行标记时发现：Nestin和Musashi呈双重阳性,且随着NSC分化成为神经元,二者的标记作用也消失,说明Musashi具有与Nestin相似的特异性和种间保守性。Nestin和Musashi作为早期原始神经细胞的标志物已被广泛地应用于NSC的鉴定。 应用前景 NSC原位诱导内源性NSC的自身激活 　理论依据：大量体外和在体实验已经证实成年脑中存在NSC。研究影响NSC增殖和分化的信号作用的实验证实：脑室管膜下区等部位的NSC在脑损伤发生后能够增殖，并迁移到受损部位并分化成新的神经细胞，取代受损脑组织细胞。 　存在困难：在大多数情况下,仅由内源性干细胞产生的神经组织可能不足以替代损伤后缺失的神经组织,尤其在脊髓、纹状体等神经组织发生很少的部位。 　可能原因： (1)原位诱导出功能特异的神经元可能需要多种刺激和特定细胞因子的作用。(2)患者中枢神经系统的干细胞缺陷或无法激活。 异体神经干细胞移植 依据：临床试验表明，移植胎儿脑组织治疗神经系统退行性疾病可以明显改善症状；在体外培养扩增的NSC移植到脑疾病动物模型脑内的实验表明，体外培养的NSC移植到脑内后能够迁移分化为特定部位的神经细胞，其分化方向与所处的微环境密切相关。 问题： （１）但胎脑的来源有限，受伦理和法律上的束缚，限制研究的发展；（２）在研究细胞移植治疗帕金森病时发现,在体外实验中没有必需的因素干预下, NSC自然分化为多巴胺能神经元的比例只占细胞总数的0.5%～5%。 　　因此，诱导NSC向修复所需的神经功能(目的)细胞分化成为研究的核心问题。 基因治疗 　　　基因治疗是通过特定载体相关外源基因导入体内,使其获得表达,达到治疗由于某种基因缺陷或突变引起的疾病。 　　　目前神经系统基因治疗常用的靶细胞有：(1)成纤维细胞,来自间充质,能在体外分裂增殖,具有较高的病毒感染率但植入脑后不能与宿主整合；(2)永生化神经祖细胞,体外容易进行基因转导和能与宿主整合等优点,但存在致癌的危险；(3)NSC来源于神经组织,比永生化NSC更能保持原有的生物学特性,具有分化能力和更好的组织相容性,可以整合到宿主脑组织并向周围迁移,不形成肿瘤等。 　　　NSC具有稳定的生物学性状,建系以后可以获得均一的遗传背景,具有组织和种属特异性，可作为神经系统疾病的药物筛选平台。利用NSC的多向分化潜能,可筛选出控制和促进NSC向终末细胞分化的药物。 神经系统疾病的药物筛选平台 神经干细胞用于治疗的可能机理 １、患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位。 ２、神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复。 ３、神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路