植物外源基因转化方法及转化子的检测资料.ppt

* 电击法的转化效率与化学法相似。它除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便，DNA转化效率高，特别适于瞬时表达的研究。缺点是造成原生质的损伤。 超声波介导基因转化 超声波基因转化的基本原理是利用低声强脉冲超声波的物理作用,击穿细胞膜造成通道,使外源DNA进入细胞。 操作过程：取无菌的试管苗中部展开的叶片，切成小块，并在叶片上针刺若干小孔，放入超声小室中。同时加入5%DMSO缓冲液3ml，质粒DNA20μg/ml 及鲑鱼精DNA40μg/ml ，室温下超声处理30分钟。 超声波所特有的机械作用，热化作用和空化作用，穿透力大，在液体和固体中传播衰减小，界面反射造成叶片组织受超声波作用的面积较大等特点，使得转化效率较高。 该方法有以下优点，操作简单，设备便宜，不受宿主范围限制，转化率高等。与其他方法相比具有更大的潜力，但该转化系统尚待进行深入研究，使之完善。 显微注射介导基因转化 显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很快，并在理论技术上有所创新。 其原理比较简明，是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞质或细胞核中。显微注射的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。 转化的成功率高 可以省去选择性标记的麻烦 基因枪法 基因枪法又称微弹射击法。 其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的DNA进入细胞后整合到植物染色体上得到表达，从而实现基因转化。 是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。 在禾本科作物上应用较广泛。 基因枪转化的操作步骤 靶细胞或组织的预处理 微粒子弹的制备 装备基因枪 轰击 过渡培养 进行筛选培养或直接分化再生植株 PDS-1000 | He System 便携式基因枪 基因枪法转化的优点有： 无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。 靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。 操作简单快速 但该方法转化率低，外源DNA整合机理不清楚。且形成 多拷贝 3.4花粉管通道法 花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。这一技术可以应用于任何开花植物。该方法是有我国科学家周光宇等（1983）建立并在长期科学研究中发展起来的。 微注射法：一般适合于较大花的农作物如棉花等。利用微量注射器将基因溶液注射进入受精子房 柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液滴加在柱头上 花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒，让花粉粒吸入基因，然后授粉。 优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一套人工培养过程。方法简便；单、双子叶植物均可应用；育种时间短。 这一技术局限欲开花时间才能应用；对DNA大小纯度要求高。机理？ 常用植物基因转化方法特点比较 转化方法 农杆菌法 PEG法 电击法 微针注射法 基因枪法 花粉管通道法 受体材料 完整细胞 原生质体 原生质体 原生质体 完整细胞 卵细胞 宿主范围 有 无 无 无 无 有性繁殖植物 组培条件 简单 复杂 复杂 复杂 简单 无 嵌合体比例 有 无 无 无 多 无 操作复杂性 简单 简单 复杂 复杂 复杂 简单 设备要求 便宜 便宜 昂贵 昂贵 昂贵 便宜 工作效率 高 低 低 低 高 低 单子叶植物应用 少 可行 可行 可行 广泛 广泛 4.植物基因转化系统的选择原则 对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌载体转化系统，因为农杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转化系统，而且转化效率高，转化植株的遗传稳定性最好。 原生质体培养容易的植物应该选择直接转化系统，因为其优点是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题。 多胚珠植物可试用花粉管通道法，因为涂抹在柱头上的外源DNA可以随着许多花粉管进入子房，分别导入各卵细胞中，提高转化率。 子房中有较大单胚珠的植物如核果类植物，宜试用显微注射法，因为将外源DNA直接注入卵细胞的可能性较大。 转化难度大的植物，即对农杆菌转化不敏感，原生质体培养困难的植物，应采用基因枪法。 根据供试外植体的特点选择相应的转化方法，如以整体植株为试材，则应采用注射法和花粉管通道法；以叶片为外植体，则应用农杆菌载体叶盘法或基因枪法。 5.转基因植物的检测鉴定 进行基因转化后，外源基因是否进入植物细胞，进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上，整合的方式如何，整合到染色体上