方竹种质资源遗传多样性研究.docVIP

方竹和合江方竹种质遗传多样性研究 刘跃钧 陈世通2 王立平3 傅兵4 （1丽水市林业科学研究院，浙江丽水323000；2丽水九龙国家湿地公园管理处，浙江丽水 323000；3 遂昌县林业局 ，浙江遂昌323300；4丽水职业技术学院，浙江丽水323000） 摘 要：目的 建立及优化方竹和合江方竹的ISSR-PCR反应体系，分析其12个种质资源的遗传多样性。方法 采用L16（45）正交试验建立、优化ISSR-PCR反应体系，利用该体系分析12个不同种源的方竹和合江方竹的遗传多样性。结果 最佳ISSR-PCR的最佳体系为：MgCl2 2.5 mmol/ L、dNTPs 100 μmol/ L、Taq 0.8U、引物0.1μmol/ L、DNA 20ng、1×Reaction Buffer。12个供试竹种被分为两大类群，其中除方竹遂昌种源2外的其他方竹竹种亲缘关系相当接近，归为一个亚群；合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源归到一个小亚群中。 关键词：方竹；合江方竹；分子标记，遗传多样性；研究 寒竹属（Chimonobambusa Makino）隶属于禾本科植物，其下有八月竹、大明山方竹、寒竹、毛环方竹、武夷山方竹、永善方竹、大叶方竹、合江方竹、云南方竹等20余种。我国拥有全部种类，其主要分布在秦岭以南各省区，比较集中的地区如四川、贵州等西南各省区。 表1 寒竹属12种不同竹种采集地点 种质 代号 种名 种源 种质采集地点 1 合江方竹 丽水种源 丽水市林科院百果园 2 合江方竹 杭州种源 浙江省林科院竹种园 3 方竹 莲都种源1 莲都区城西村 4 方竹 莲都种源2 莲都区大港头镇栋头村 5 方竹 遂昌种源1 遂昌县贵阳林场 6 方竹 遂昌种源2 遂昌县三仁乡林业站附近 7 方竹 松阳种源1 松阳县竹源乡小竹溪村 8 方竹 松阳种源2 松阳县三都乡 9 方竹 松阳种源3 松阳县竹源乡后畲村 10 方竹 景宁种源 景宁县东坑镇杨斜村 11 方竹 庆元种源 庆元林场场部 12 方竹 杭州种源 浙江省林科院竹种园 由于竹子是一类生物学特性特殊的植物，以地下鞭延伸为主的无性繁殖方式，以及开花时间、空间上的不确定造成有性繁育系统的缺乏，所以在亲缘关系鉴定遗传图谱的建立等方面都存在着很大的困难。ISSR (inter sample sequence repeat) 分子标记由于不受环境及发育阶段的影响技术 利用ISSR分子标记hejiangensis）和方竹（C. quadrangularis）不同种源之间的的遗传多样性，为。1.2 基因组DNA的提取 用Plant DNA Mini Kit试剂盒OMEGA公司抽提叶片组织的基因组DNA。琼脂糖胶电泳检测基因组DNA的大小完整性，并用UV-2802S ()测定基因组DNA的浓度和质量。 1.3ISSR-PCR反应条件及程序借鉴杨本超[2]、王涛[3]的反应体系及参数，并进行适当优化。前期的研究发现，反应体系中加入2% (v/v)去离子甲酰胺，1% (v/v)甘油，可提高PCR反应的特异性，同时使条带清晰。本研究的-PCR反应为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，50℃(退火温度随引物不同而变化)退火1min 30s，72℃延伸1min 30s，重复30个循环；最后为72℃延伸10min，4℃保存。μmol/ L ) Taq/U 引物 (μmol/ L) DNA/ng 1 1.0 100 0.2 0.1 10 2 1.0 200 0.4 0.2 20 3 1.0 300 0.6 0.3 30 4 1.0 400 0.8 0.4 40 5 1.5 100 0.4 0.3 40 6 1.5 200 0.2 0.4 30 7 1.5 300 0.8 0.1 20 8 1.5 400 0.6 0.2 10 9 2.0 100 0.6 0.4 20 10 2.0 200 0.8 0.3 10 11 2.0 300 0.2 0.2 40 12 2.0 400 0.4 0.1 30 13 2.5 100 0.8 0.2 30 14 2.5 200 0.6 0.1 40 15 2.5 300 0.4 0.4 10 16 2.5 400 0.2 0.3 20 1.4 ISSR引物的筛选 参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套ISSR引物序列合成所用的ISSR引物，共60条（UBC821-880），引物由北京全式金生物技术有限公司合成。以浙江省林科院竹种园合江方竹基因组DNA为模板，进行引物筛选。 1.5电泳及染色 将筛选得到的引物分别以所有供试竹种基因组DNA为模板进行PCR反应。待反应结束后，.5%聚丙烯酰胺凝胶（EB