AFB1高效液相测定法衍生和未衍生的比较.doc

HPLC 柱前衍生法分析黄曲霉毒素 B1 黄曲霉毒素（AFT）对有机体具有致突、致癌、致畸性，被列为可能的人体致癌物质。 黄曲霉毒素在多种人类食物中被发现，如玉米、坚果、花生等等，以 B1、B2、G1、G2 的形式存在。AFTB1 在动物体内可转变成两种主要代谢产物- AFTM1 和 AFTQ ,前者的毒 性和致癌性与AFTB1相近,主要存在于动物 的尿和乳汁中。 黄曲霉毒素可使用正相和反相液相色谱法分离，反相色谱法操作较容易、流动相毒性也较低，被广泛采用。使用反相液相色谱检测时，可通过柱前衍生法或柱后衍生法，提高AFTB1 、AFTG1的检 测灵敏度 ，使之与 AFTB2、AFTG2 在相近水平下检测。柱前衍生法无需专用柱后衍生反应系统，方法简单。本方法通过三氟乙酸（TFA）柱前衍生，HPLC 检测黄曲霉毒素 B1。该方法可用于 4 种黄曲 霉毒素 B1、B2、G1、G2? 同时检测，也可用于 AFTM1 检测。 ?样品前处理 取 50μL 黄 曲霉毒素 B1 标样溶 液 (10ng/mL，溶剂苯-乙腈溶液(98:2 v/v))，用氮气吹干，加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸， 混匀1min，室温下放置10min，氮气吹干，用乙腈水溶液(乙腈/水 85：15 v/v) 50μL重新溶 解，混匀30s，经0.45μm滤膜过滤，供液相色谱仪检测用。 LC 分析条件 仪器：Shimadzu? ?LC-20A? ?液相色谱系统（含 LC-20AT 二元泵、CTO-20A 柱温箱，RF-10AXL荧光检测器，LCsolution 色谱工作站） 色谱分析条件 流动相：甲醇:乙腈:水=1:3:6 流速? ：1.0mL/min 色谱柱：Shim-pack GVP-ODS (4.6mm*10mm)；Shim-pack VP-ODS (4.6mm*150mm,5μm) 激发波长 365nm?发射波长 425nm 柱温：40 进样量：10μL 分析结果 黄曲霉毒素 B1（AFTB1）标样色谱图及分析结果? 表 1??? 黄曲霉毒素 B1 分析结果? 化合物 标样浓度 (ng/mL) 保留时间 (min) 峰面积 峰高 AFTB1 衍生 10 3.368 329246 37098 AFTB1 未衍生 10 6.721 12685 1024 ?结论 三氟乙酸柱前衍生法可用于AFTB1检测，增强其荧光强度，提高检测灵敏度。通过以上实验检测 AFTB1 标样（10ng/mL），未经衍生标液的信噪比为 42，衍生后信噪比提高至S/N=1434? HPLC柱前衍生化法检测中草药中的黄曲霉毒素 来源:医学论文网- 　　0 引言　　　　黄曲霉毒素主要是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的一组结构类似的二呋喃香豆素的衍生物[1]。黄曲霉毒素具有致癌性、致突变性及致畸性，可引起肝细胞变性、坏死[2]。随着黄曲霉毒素限量的日益严格,对检测方法在灵敏度、定量准确度和自动化方面提出了新的要求。目前国际上测定黄曲霉毒素常见的方法有生物鉴定法、薄层层析法( TLC) 、酶联免疫分析法、高效液相色谱法。生物鉴定法主要用于定性，方法专一性差，灵敏度低，一般只作为化学分析法的佐证；薄层色谱法操作繁琐、污染大科技成果转化、定量差、耗时长；而酶联免疫法虽然操作简单、灵敏度高，但特异性差，一般只能达到筛选的目的，不能作为常规定量检测用[3]；荧光强度的目测精确性较差，特异性不强和安全性能较差，主要是半定量；高效液相色谱法(HPLC)的灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果准确可靠[4]。因此建立一种利用高效液相色谱来分析中草药提取物中黄曲霉毒素的方法,是十分必要的[5]。　　　　1 材料和方法　　　　1.1 材料　　1.1.1 试剂　　水为三蒸水，甲醇（色谱纯，S K chemicals 公司），三氟乙酸（色谱纯，天津市光复精细化工研究所），乙腈（色谱纯，MERCK 公司），正己烷（色谱纯，Brudick Jackson 公司）。 黄曲霉毒素B1（3μg/ml）,B2（3μg/ml）,G1（3μg/ml）,G2（3μg/ml）(Sigma 公司)　　1.1.2 器材和仪器　　Waters1525 高效液相色谱仪，Waters2475 荧光检测器；HYA-II 恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；涡旋混合器（MS2 Minishaker）；免疫亲和柱（LCTech GmbHAflaCLEANTM）；超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-500；DHG-9070A 星电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；石英自动双重纯水蒸馏器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公