ChapterCloninginEcoliexpressionsystem解读.ppt

Clonging in E.coli 二 大肠杆菌表达载体的基本组成 1启动子 可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件 1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10 % - 30 %以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平 3 ) 应该是诱导型的 , 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。 b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 , 那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。 在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。 4、reporter gene 三 常用的大肠杆菌表达载体启动子 四 真核基因在大肠杆菌中的表达 1 ) 细胞质中表达 expressed in cytoplasm 周质 : 指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 在大肠杆菌中 , 已成功的使用了各种不同类型信号肽 ,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。 3) 分泌表达 使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化 , 这种研究思路称为外源蛋白质的分泌表达。 二种类型 由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。 由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动子构成。用于生产新型融和蛋白。 使克隆外源基因有效转译 有效转译：取决于核糖体的结合位点 , 受到编码区起点核苷酸序列影响。 可使蛋白质产物稳定 , 免受寄主胞内酶的降解作用 ,因此可以得到较高的产率。 可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞的正确位置。 能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。 1基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制； 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解 2 工程菌遗传不稳定性的产生机制 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应 ， 关闭合成途径 ，启动降解 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 Deletion 以构建稳定性高质粒: 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中: 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 3 改进载体、受体系统 正确设置载体上的多克隆位点: 禁止DNA片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上，并构建条件致 死性的相应受体系统 。 eg:大肠杆菌的ssb基因 (DNA单链结合蛋白编码基因) Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business *Principles of Gene Manipulation by liuzengran Hebei University of Economics and Business 大肠杆菌表达系统 Chapter 8 Class period 2h Need to master the expression methods in E. coli Need to know how to get a mutant by homologous recombination Objective Demands be familiar with vectors used in E. coli Main content 一：大肠杆菌表达外源基因的优势 二 大肠杆菌表达载体的基本组成 三 常用的大肠杆菌表达载体 四 真核基因在大肠杆菌中的表达 五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题 六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 七. 人胰岛素的生产方法 一：大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin) periplasm heterogous 一个良好的大肠杆菌表达载体： 有抗菌素抗性基因 决定载体拷贝数的复制起点 (ori ) 供外源基因插入的多克隆位点。 参与控制转录与翻译的