chapter酶的提取与分离纯化解读.ppt

垂直板电泳 毛细管电泳 水平板电泳 圆盘电泳 (三) 离子交换色谱 离子交换层析是利用在离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种物质的吸附力不同而使不同物质分离的方法。 离子交换剂分为两部分：一部分是不能移动的多价的高分子基团，构成骨架；另一部分是活性离子，它在树脂中进出发生离子交换。 活性离子是阳离子，能吸附阴离子的称为阳离子交换树脂；相反则称为阴离子交换树脂。 离子交换法 离子交换Flash 四、根据亲和作用建立的纯化方法 由于酶对底物，竞争性抑制剂,辅酶等配体具有较高的亲和力，而其它杂蛋白对这些配体则没有或有很弱的亲和作用，因此，可以根据酶与杂蛋白对配体亲和力的差异，很容易地将酶分离出来。目前已经建立的方法有亲和层析法和亲和电泳法等。 1、亲和层析法： 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。 酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用. 亲和层析的四个要素 载体 配体 臂 待分离组分 亲和吸附 洗涤洗脱 再 生 杂蛋白 目的酶 图. 亲和分离原理示意图 亲和层析 亲和层析过程： 1、 固定配基 2、装柱 3、吸附 4、解吸 载体：必须高度亲水，使蛋白质分子容易接近。（常用：琼脂糖凝胶） 配基：具有可供偶联的活泼基团，结合后不会影响配基和酶之间的相互作用。 亲和层析Flash 根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为： 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析 2、亲和电泳： 将亲和配体共价偶联于电泳凝胶上，由于亲和作用，待分离的酶与配体结合后，在电泳中不再移动，而其它杂蛋白不与配体结合，使目的酶分离出来。 五.酶的浓缩、干燥与结晶 浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。 离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。 在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有： 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥 结晶： 溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。 结晶既是酶是否纯净的标志（只有同类分子才能形成晶体），也是一种酶和杂蛋白分离的方法。 当溶液达到饱和状态时开始结晶作用，但只有当达到过饱和状态时才可能析出结晶。 结晶包括3个过程：形成过饱和溶液，形成晶核，晶体生长。 需要注意的是过饱和状态的形成应该是一个缓慢的过程，否则会形成无规则的沉淀而不能形成晶体。 1、结晶的基本原理 （1）酶的纯度：达到50%以上； （2）酶蛋白的浓度：3-50mg/ml； （3）晶种（在结晶条件下加入）； （4）温度:（0-4℃）； （5）pH值：应在酶的稳定范围内，一般选在被结晶的pI值附近； （6）金属离子：（如Ca2+ , Mg2+ 等） 2、结晶的条件 (一) 盐析结晶法 采用一些中性盐如硫酸铵等，慢慢增加盐浓度至浑浊为止，然后静置，进行结晶。 (二) 有机溶剂结晶法 在含有少量无机盐和适宜pH条件下，在冰浴中缓慢加入有机溶剂（如乙醇，丙酮等），并不断搅拌，到出现微浑浊时静置数小时。 (三) 透析平衡结晶法 透析平衡结晶是将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。(四) 等电点结晶法 等电点结晶是通过缓慢改变浓酶液的pH值，使之逐渐达到酶约等电点，而使酶析出结晶的过程。 六、酶的制剂与保存 液体酶制剂：一般将固体杂质去除后，直接制成或浓缩成粗酶液；不稳定，且成分复杂。 固体酶制剂：发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥而成；有的是经过初步纯化后，加入淀粉等填充料而成；适合运输和短期保存，用于工业生产。 纯酶制剂：分离纯化后的酶液，经浓缩或结晶等制成；适合于生化试剂或医疗药物。