藕节多糖实验方案.docVIP

藕节多糖提取与抗氧化性 一．藕节多糖的提取：藕节洗净，切去杂质部分，烘干，称量记录数据。于去离子水中熬煮，约一个小时，取汁，记录汁液的毫升数。汁液于蒸发浓缩器中蒸发，大约蒸至原体积的四分之一时停止。记录所得的浓缩汁液。用3倍的95%的无水乙醇浸没浓缩液，醇提一天。 醇提后冷冻离心，取底料，用95%的无水乙醇多次洗涤，冷冻干燥，称量记录数据。 二．标准曲线的制作：1.仪器：电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管 2试剂： (1)葡萄糖标准液：l00 μg/ml (2)浓硫酸 (3)蒽酮试剂：0.2 g蒽酮溶于100 ml浓 H2SO4中。当日配制使用 操作步骤 1.葡萄糖标准曲线的制作 取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液： 管号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖标准液（ml） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 蒸馏水（ml） 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 葡萄糖含量（μg） 10 20 30 40 60 80 在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0m1，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸l0 min取出，用冰浴冷却至室温，在620 nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量（μg））───────────── × 100 W × V测 × 106 其中：C——在标准曲线上查出的糖含量（μg）总体积（ml）测定时取用体积（ml）D——稀释倍数W——样品重量（g）106——样品重量单位由g换算成μg的倍数OH能力，清除O2-·能力，清除DPPH·能力 金属鳌合力的测定） 1. 清除O2-·能力： 邻苯三酚自氧化法是测定清除O2-·活性的常用方法。邻苯三酚在pH=8.2的Tris-H缓冲溶液中自氧化可产生O2·和有色中间产物中间产物在紫外区有吸收经波长扫描，在320 nm处有最大吸收，故可用紫外分光光度仪来定量测定天然抗氧化剂在此体系中对超氧阴离子自由基的清除作用。 在320 nm处测定吸光取取Tris 6.0570 g，浓盐酸（38%，12 N） 0.4564 mL，定容至 1 L0.05 mol/L pH=8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL于试管中，置25 ℃水浴中预热20 min，分别加入不同浓度的1 mL和0.2 mmol/L的邻苯三酚溶液0.5 mL，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，加入1.0 mL 8 mol/L HCl终止反应，在320 nm处测定吸光度A1。空白对照以同体积的蒸馏水代替样品提取液，吸光度记为A0 ；用同体积的蒸馏水代替邻苯三酚溶液记为A2 。每组测定三次取平均值。根据公式计算清除率K： K= [A0(A1-A2)]/A0×100% 式中：A0为不加样品的吸光度，A1为加样品的吸光度，A2为样品在体系中的吸光度 参照Fenton反应的方法建立反应体系模型，利用H2O2与二价铁离子混合后产生·OH，即：H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+。Fe2+ 形成稳定的橙红色络合物，且这种络合物在536nm波长处有最大的吸收峰。羟自由基具有很强的氧化性，会将一部分Fe2+ 氧化成Fe3+，使得橙红色络合物减少。若在此反应体系中加入抗氧化剂，让它与体系中自由基和氧化剂反应，使得Fe2+的减少受到抑制，即使得橙红色络合物的减少受到抑制。利用紫外分光光度计在5nm处测量，便能测定被测物对·OH清除作用7. 4 的PBS溶液()作空白参比，在536 nm 波长下测定吸光度。分别精确吸取5 mmol/L邻二氮菲溶液(以水 将50 m mo l/ L邻二氮菲无水乙醇溶液稀释至5 m mo l/ L)0. 5 mL置于各个洁净的10 mL刻度试管中，再依次分别加入pH =7. 4 的PBS溶液2 mL，混匀；加入7.5 mmol/L 的FeSO4溶液(使用时最好现用现配)1 mL，混匀；加入0.2%过氧化氢溶液1 mL（0.5ml），加水定容至刻度，摇匀，37℃恒温水浴下反应1 h(50min)。（取出时应立即将试管放入冰水浴中，让3 7 ℃反应立刻终止，然后再拿去比色。）在536 nm 波长下测定吸光度A1。同上法，但分别多加入1 mL不同浓度提取液，蒸馏水定容置刻度，测定吸光度A2；不加过氧化氢溶液和提取液，蒸馏水定容置刻度，测定吸光度A0 。以Vc和BHT作阳性对照，比较待测液的抗氧化能力。每组测定三次取平均值。根据公式计算清除率K：K=[（A2-A1）/（A0- A1）]×100% 式中：A0为，A1为，A2为的吸