Chapter基因工程解读.ppt

基因工程 第一节 概述 １.概念 　　基因工程：在分子水平上，将某种生物的基因或基因组转移到另一生物中去使后者定向获得新遗传性状的一门技术。 　　基因工程技术(重组DNA技术)的建立，使实验生物学领域产生巨大变革。 2. 发展 1971年　史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。 1972年　伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和λ噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的DNA分子。 1973年　科恩（Cohen S.）等进一 　　　　步将酶切DNA分子与质粒 　　　　DNA连接起来，并将重组 　　　　质粒转入E. cloi细胞中。 3.基因工程主要步骤 　①．分离和鉴定目的基因； 　②．构建的重组DNA分子：基因的体外重组； 　③．转基因技术：把重组DNA分子引入宿主受体细胞； 　④．筛选重组子：具有重组DNA的无性繁殖系或个体； 　⑤．外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向性状变异的个体。 第二节 植物基因工程 转化方法： 1、农杆菌介导的方法 2、基因枪法 3、花粉管通道法 一、农杆菌介导的方法 （一）农杆菌的Ti质粒载体 质粒上一段DNA称为T-DNA（Transfer-DNA) ? 能转移并整合到植物基因组中 （二） Ti质粒转化农杆菌 1、冻融法 2、三亲杂交 3、电穿孔 二、基因枪法 目的基因用金粉或钨粉包裹成直径1~4μm颗 粒，再利用基因枪以火药爆炸或压缩氦气为动 力将DNA颗粒以300~600m/s的速度打入植物细 胞。 第三节 动物基因工程 转基因动物的方法 1、逆转录病毒感染法 2、DNA显微注射法 3、胚胎干细胞法 一、逆转录病毒感染法 是利用反转录病毒载体将外源基因转入动物胚胎早期细胞，与受体细胞核基因组整合，然后移植到受体动物中。 二、显微注射法 显微注射示意图 获得转基因鼠的纯合鼠系 三、胚胎干细胞法 1、电穿孔法 2、磷酸钙转染 3、脂质体转染 4、DEAE-葡聚糖法 1、电穿孔法： 通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。 2、磷酸钙转染： 最早在1973年开始采用。氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。 3、脂质体法： 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。 带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 4、DEAE-葡聚糖法： 带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。 通过胚胎干细胞获得转基因鼠 第四节 转基因检测 PCR Southern-blot 检测DNA Northern-blot 检测RNA Western-blot 检测蛋白质 性状观察 第五节 基因治疗 一、基因治疗（gene therapy）的概念 是向靶细胞导入外源基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗遗传病的目的。 二、基因治疗的条件 1、对导入的基因及其产物有详尽的了解 2、外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、 适量表达； 3、不能使受治细胞基因组及表达调控受影响； 4、导入基因方法安全，载体对靶细胞无害； 三、基因疗法的步骤 1、目的基因的选择： 根据基因治疗的类型选择相应的目的基因（增补、替换、添加） 2、基因载体的构建：使目的基因在受体细胞内高效、可控、稳定地表达 3、受体细胞的选择：容易分离获取，在体外增殖存活，大量扩增。如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞等。 四、导入的方式 1、体外导入（ex vivo） 体外将基因导入细胞内 再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内 使这种带外源基因的细胞在体内表达 达到治疗或预防的目的 2、体内导入（in vivo） 外源基因直接导入体内有关的组织细胞 使其进入相应的细胞 在细胞内表达 * * * *