基因工程制药技术()解读.pptVIP

第二章 基因工程制药技术 基因工程菌构建流程 一 表达载体构建 表达载体设计 目标基因的定位克隆 酶切反应 连接反应 转化 筛选与鉴定 1.表达载体的设计 2、目标基因PCR定位克隆 3.酶切反应和连接反应 限制性核酸内切酶 连接酶 4.转化、筛选与鉴定 筛选方法 将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。 （1） 遗传学方法 A. 抗生素筛选法 a. 单抗生素筛选 大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（ampicillin, Amp）、四环素(tetracycline,Tet)、卡那霉素(kanamycin, Kan)抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。 b. 双抗生素筛选 B. 蓝-白筛选（α互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α互补。 因此，当载体的多克隆位点没有插入外源DNA片段时，α互补能正常进行，产生有活性的β-半乳糖苷酶。 能使人工底物X-gal变成蓝色, 产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多克隆位点插入了外源DNA片段，导致产生无α互补能力的氨基端片段, 带重组体的细菌形成白色菌斑或菌落。 （2） 免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。 （3） 核酸杂交法 对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。 鉴定方法 菌落PCR：是否含有目标基因 载体大小：电泳检测 酶切鉴定：插入片段大小及插入方向 测序确证：目标基因的序列准确无误，阅读框架通读 二 基因工程菌的构建 基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。 基因工程菌种类： 细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。 1.大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达系统是发展最早、应用最广泛的经典的表达系统 优点： 遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70％），培养周期短，抗污染能力强 缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性 不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达 细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热原 基因工程大肠杆菌的应用 多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽） 激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化) 细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干扰素β和γ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂 溶栓酶类：rPA 白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等 PEG 聚乙二醇（PEG）是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相容性的高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。 具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。当藕联到药物分子或药物表面时，能 　　 防止肾小球滤过 　　 减少免疫原性 　　 阻止蛋白酶降解 2. 酵母表达系统 优点： 安全、无毒。 营养缺陷选择外来质粒。 培养条件简单、大规模培养技术成熟。 亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。 缺点： 酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。 修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。 基因工程酵母的应用 1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素 激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素；细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子 多肽类：高血糖素 2种乙肝疫苗等。 水蛭素 重组水蛭素是用基因工程通过大肠杆菌、噬菌体或酵母菌表达产生，其氨基酸序列和结构与天然水蛭素唯一不同的是其63位酪氨酸残基未硫酸化，该特点使其对凝血酶的抑制作用明显降低，仅为天然水蛭素的1/10。但这种方法能获得相当量的重组水蛭素，所以极大地推动了水蛭素的药理