实验二PCR技术及其应用资料.pptVIP

实验二 孔忠新 2015.10.13 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction, PCR “经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 —— Korana于1971年 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件： 模板DNA， 寡核苷酸引物， DNA聚合酶， 合适的缓冲体系， DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR技术基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 变性--退火--延伸 变性：加热至93℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备 退火(复性)：模板DNA变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 延伸：模板-引物结合物在Taq聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补链，这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 图 PCR扩增DNA原理示意图 ①变性（95℃）；②退火；③延伸（72℃） PCR仪 PCR标准反应体系 DNA模板 0.1～2ug 引物 10～100pmol 反应缓冲液 10ul dNTP 各200umol/L 耐热聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L ddH2O 加至 100ul 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓度 应适当,过高导致非特异性增加,过低则 引 物 扩增产物太少 反应体系对PCR扩增的影响 反应Buffer pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂 Mg 2＋浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当 避免反复冻融 ddH2O pH值适当 避免污染 0.2kb 0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.5kb 0.3kb × 0.2kb 0.3kb 0.5kb 品系1 品系2 450bp 420bp 品系1 品系2 (GCA)150 (GCA)140 Chr A Chr B 465bp 435bp (GCA)155 (GCA)145 Chr A Chr B 品系1 品系2 1.5kb 品系1 品系2 特异性片段的PCR扩增 1.5 kb 基因1 Chr A Chr B Chr A Chr B 品系2 品系1 ? × × 不同类型的PCR策略 Tail-PCR 定量PCR(quantitative PCR, qPCR) 半定量PCR(semiquantitative PCR, sqPCR) 反向PCR ( Inverse PCR , IPCR) 锚定PCR (Anchored PCR , A-PCR) 不对称PCR (asymmetric PCR) 技术 反转录PCR ( reversetran scription, RT-PCR) 修饰引物 PCR 巢式 PCR (N E ST PCR) 等位基因特异性 PCR (Allele-specific PCR, A-SPCR) 原位 PCR ( in situ PCR) 长片段 PCR (long - PCR) 荧光定量PCR基本原理 实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。 初始模板浓度定量 初始DNA量越多, 荧光达到某一值（阀值）时所需要的循环数越少。 Log 浓度与循数呈关系，根据样品扩增达到阀值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。 PCR标准反应体系中量的问题 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 模板