白介素12抑制HBV转基因小鼠体内乙肝病毒的复制.docVIP

白介素12抑制乙肝病毒在转基因小鼠体内的复制 摘要：HBV转基因鼠，重组IL-12能够启动不伴有细胞坏死的抗HBV免疫反应重组DNA斑迹法证明重组白介素12能够在不发生或只发生轻微炎症的剂量下促使HBV复制中间产物从肝肾组织中完全消失，说明重组白介素12对肝和肝外的HBV病毒复制有较强的抑制作用白介素治疗后的肝肾组织诱导产生IFN-, 肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IFN-α/β mRNA，其抗病毒主要是IFN-γ所的。这些结果，白介素12IFN-γ，白介素12在慢性HBV感染 在HBV感染过程中， 抗原细胞免疫反应起着重要作用急性HBV，多克隆的多特异性的。相反先前证实HBV特异性细胞毒性淋巴细胞能HBV转基因的小鼠肝是由抗原许多研究证实IL-12在病毒细菌寄生虫霉菌感染等起到重要的作用 材料和方法 HBV 转基因小鼠谱系1.3.46（官方指定T Tg [HBV 1.3 genome] Chi46)。这些动物通过显微注射(法)DNA末端植入近亲小鼠B10.D2的胚胎。谱系1.3.46通过重复的与B10.D2 逆代杂交， 白介素12Maurice Gately(Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J.).惠赠。…14天腹腔连续注射重组IL-12，剂量从1ng/300ul到1ug/300ul，用含有1%1.3.46和BALB/c小鼠第一代杂交鼠血清的生理盐水稀释IL-12，对照组只有含1%血清的生理盐水。最后一次注射IL-12 16h后将动物处死，将肝脏和脾脏收集用于实验分析。尸检取组织标本进行组织学病理学研究，其余放入液氮或-80摄氏度用于DNA和RNA分析HBV DNA 分析，冰冻的肝肾机械，。通过DNA HindIII消化的DNA进行分析，了解HBV复制。在电泳前，所有DNA 样本都在37摄氏度下10 ug/ml RNA酶水解。(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, Ill.) 与含有32P放射标记的HBV特异性DNA探针相混合。在谱系1.3.46 转基因是染色体组中单一位点的改变，它不包括HindIII的1.6kbp单链线性，3.2kbp双链线形的, 和3.5年龄和性别相的B10.D2 3 BALB/c小鼠的混合血清为阴性对照。 RNA分析法 RNA 冰冻的组织通过机械，整条RNA由酸性[防腐药] 萃取，取RNA（20mg）分析HBV三磷酸2，5-腺嘌呤核苷酸合成酶表达。 核糖核酸酶保护测定 利用一组线形的亚克隆作为模板，在T7聚合酶指导下定向合成32P标记的反义RNA探针。 免疫组织化学分析方法 胞内乙型肝炎核心抗原的分布由通过生物素标记示踪法检测。一抗是兔抗HbcAg免疫血清，二抗是羊生物素抗兔免疫球蛋白。抗生物素-辣根过氧化物酶复合物、3-氨基-9乙基咔唑作为染色底物。 疾病的生化和组织分析方法 检测肝细胞损伤通过测量在注射IL-12后的时间的血清谷丙转氨酶活性。肝肾样本被保存于含10%缓冲液的 3 mm的切片，用H22用于检测Mifn-γ，仓鼠单克隆抗体TN3 19 用于检测mTNF-a，羊中和性免疫球蛋白用于检测mIFN-α/β。纯化的仓鼠免疫球蛋白G和正常的G都用做对照。 结果 IL-12抑制HBV转基因小鼠肝肾的HBV复制。 为证实IL-12HBV复制的，转基因小鼠治疗时用重组鼠IL-12剂在其他(3, 12, 32–34)可用于提高抗各种病毒感染的能力的在1, 10, or 100 ng 的 IL-12，连续注射三天，它们的肝在最后一次注射16小时后被采集做DNA 分析。这些结果与来自注射了盐稀释液相比。图1剂量依赖性，研究的转基因小鼠的HBV 病毒复制不仅在还在中。(100 ng /天，连续使用3 天，在尸解时发现(25 to 50U/liter)略升高(105 U/liter)，证明了HBV复制产物的消失不是因为IL-12对肝细胞的破坏。当使用IL-12最高剂量(1 ug)，连续使用5或更多天后，血清谷丙转氨酶的活性明显升高 (5天为290 U/liter，14天为 483 U/liter)。 107 HBV-特异性CTL(2800 U/liter)，一般认为只有一小部分肝脏受损。而使用IL-121ug/天，维持14天，血清谷丙转氨酶的活性(490 U/liter)，还不到CTL损伤的五分之一。 由于IL-12是 (100 ng/天 ，连续使用3 days)，在抑制HBV复制方面几乎没有作用（见图2），诱导肝毒性。 肾组织切片组织学分析显示，连续7天或更长的接受1ug的IL-12给药的小鼠，其体内呈现包括浸润性单核细胞在内的轻度间质性肾炎（图3F）。连续5天接受1ug的IL-12的小鼠，其肾脏中几乎无HBV复制中间体生