家兔关节软骨细胞分离和培养.docVIP

家兔关节软骨细胞的分离与培养 实验动物 3周龄新西兰大白兔 实验试剂 胎牛血清, 胰蛋白酶, II型胶原酶, 台盼蓝, DMEM培养基, 甲苯胺蓝染色剂 主要试剂配制方法 1.0.01mol/L PH7.2一7.4PBS NaCI 8.0克 KCI 0.2克 KH2PO3 0.2克 Na2HPO3·12H2O 2.08克 精确称量上述药品并充分溶解于1000mL三蒸水中，用1mol/L HCI和1mol/L NaOH溶液调整pH值至7.2一7.4。 2.DMEM培养液 将DMEM干粉一包溶于1O00mL三蒸水中，按说明书加入NaHCO3，并加入双抗(终浓度为:青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)和维生素C(终浓度为:50mg/L)，调节PH到7.0一7.2，超净工作台内过滤除菌。置一200C冰箱保存备用。如需含血清的培养基，于使用前加入足量56℃水浴灭活30分钟的胎牛血清(FCS)。 .1.3主要实验仪器 倒置显微镜, 数码照相机, 二氧化碳培养箱(2300型),超净工作台(SW-CJ一IF型), 低温离心机(Megafuge1.oR型),电子天平(MAllo型) 磁力搅拌器 .2方法 .2.1兔关节软骨细胞的培养与传代 将一只健康的三周龄新西兰大白兔耳缘静脉空气栓塞处死，备皮，用碘酒消毒背部及四肢皮肤，在无菌操作下，在超净工作台内用手术刀削下双侧膝关节软骨，以不渗血为度。充分漂洗软骨小块。用眼科剪将软骨组织剪成约lmm3小的碎块，收集置于离心管中，以PBS冲洗2次，向离心管加10一巧mLO.%胰酶。吹打成组织悬液，装入50mL玻璃培养瓶。放进二氧化碳培养消化1时。消化后将培养瓶静置桌上，待软骨组织沉淀后，吸出胰蛋白酶。将配好0.10kH型胶原酶10mL以滤器过滤入培养瓶，加入0.stnL胎牛血清。放进二化碳培养箱消化4一6小时。细胞从基质中释放于消化液中，经过滤除去未 被消化的软骨碎片，将消化液置于离心管中100orpm、10min离心，弃上清液收集软骨细胞，加DMEM液，1000印m、10而n离心，冲洗2次，弃上清液，加入上述细胞培养液(含10%FBS的青霉素、链霉素的DMEM培养液)制成细胞悬液，滤网过滤，血球计数板计数，并把细胞悬液稀释成2x105/c时的密度，接种于25c衬的培养瓶中，血球记数板计数。以台盼蓝染色法检查死亡细胞比例，死亡细胞比例约10%左右。把培养瓶置于二氧化碳培养箱中进行软骨细胞原代培养(温度37℃，饱和湿度，50k二氧化碳，950k空气)。每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况，72小时后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每两天更换培养液一次。待软骨细胞铺满瓶底后，进行传代培养。 细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察软骨细胞聚集成片，待约80%的细胞汇合，即进行细胞传代。吸除培养液，PBS清洗后，加入0.25%的胰蛋白酶ZmL，室温下静置消化5一10分钟，倒置显微镜下观察细胞质回缩，细胞重新变成圆形，细胞间隙增加，少量细胞开始浮游，此时迅速而轻柔地倾去胰蛋白酶溶液(不使瓶底细胞随胰蛋白溶液流失)。以PBS液轻洗一遍后加入新培养液。然后吹打细胞使其散开重新成细胞悬液，按前述方法分瓶培养。每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照，2一3天换液1次，待软骨细胞铺满瓶底后，再次进行传代。 1.1.2.2软骨细胞的形态学观察以及组织化学染色鉴定 1.1.2.2.1镜下观察软骨细胞并制作细胞爬片 每日在倒置显微镜下观察软骨细胞形态、生长情况，照相。将传一代细胞按2x105/c时的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的6孔细胞培养板中，培养条件与原代培养相同，制作细胞爬片。 1.1.2.2.2Gicmsa染色光镜观察 细胞70%融合时取出细胞爬片，放在冰醋酸与甲醇之比为1:3的固定液中固定10分钟。晾干用Giemsa染液(将oiemsa原液用pH6.8的PBsl:10稀释)染色15分钟。晾干后用二甲苯、透明树脂封片。倒置显微镜下观察，并行细胞照相。 1.1.2.2.3甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型 细胞在盖玻片上长满后取出细胞爬片，PBS漂洗二次，70%乙醇固定20分钟以除去四价铵离子，以免影响染色，再用PBS漂洗二次后，吹干。加入甲苯胺蓝乙醇液(甲苯胺蓝0.29溶于30%乙醇IO0ml中配制而成)染色10分钟，用蒸馏水冲洗，倒置显微镜下观察并照相。因软骨细胞分泌的蛋白多糖能被甲苯胺蓝异染，呈红色、紫红色，据此可鉴定软骨细胞的表型。 讨论 1.3.1软骨细胞的原代培养方法 过去曾经广泛认为软骨细胞不具备分裂增殖的能力，故长久以来未能开展其体外培养研究。1967年，ManningandBonner用胰蛋白