高效液相色谱课件资料祥解.ppt

高效液相色谱 ----谢艳丽 工作原理 高效液相色谱法是用高压输液泵将流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品,由流动相带入柱内, 在柱内各成分被分离后,依次进入检测器,色谱信号由记录仪或积分仪记录. 液相色谱柱 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2，苯基等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 μm之间。 色谱柱的使用 样品的前处理：a、最好使用流动相溶解样品。b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 色谱柱的使用 流动相的配制： a、流动相对样品具有一定的溶解能力。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应。 c、流动相的黏度要尽量小。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。 e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡。 f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。 色谱柱的使用 流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。 液相色谱检测器 测量原理不同分类： 光学性质检测器 紫外－可见光检测器；示差折光检测器；荧光检测器；蒸发光散射检测器；化学发光检测器 电学和电化学性质检测器 安培检测器；电导检测器；库仑检测器；介电常数检测器；极谱检测器 热学性质检测器 光声检测器；热透镜和光热偏转检测器 选HPLC参数时的基本考虑 溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 官能团 - 有否离子化基团? 保留特性如何? 样品的基质 - 考虑如何前处理 在基质中样品的含量 - 分析、制备都考虑 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异 摸索条件的重要线索 反相色谱最常用的流动相： 水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。 水－甲醇体系：大约50％水的时候粘度最大 水－乙腈体系：35％水的时候粘度最大。 色谱柱常见毛病 柱压过高 柱效低 重复性差 不出峰，回收率低 柱压过高 微粒堵塞 样品 流动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长 柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯 重复性差、回收率低 实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附 色谱柱以外的因素（一） 柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！ 系统反压问题 阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 在线过滤器不干净 保护柱 压力传感器不准确 流速是否错误? 色谱柱以外的因素（二） “柱效”问题，不一定是色谱柱问题！ 仪器问题：连接不好造成死体积 进样器 检测器 管路，连接口 保护柱 在线过滤器堵塞 流动相问题：色谱柱未平衡好 进样量太大 色谱柱以外的因素（三） 实验的重复性差 梯度实验时平衡时间不足 温度波动 流动相组成改变 样品溶剂不同 样品稳定性不好 方法的开发不好 缓冲液的pH值不合适 缓冲液的缓冲能力不足 流动相的脱气 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 流动相脱气的方法 加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波 简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气，多用于低压梯度 脱气机 可保持连续脱气，多用于低压梯度 样品的预处理 样