cdna文库建立流程要点解析.docVIP

cDNA文库组标准流程 一. Total RNA的提取 1 二. mRNA的分离 6 三．cDNA双链合成 8 四．载体制备 11 五. cDNA双链和载体的连接 14 六．电转化流程 15 七．快速鉴定、菌落PCR 17 八．pBlueScript cDNA库扩增 19 一.Total RNA的提取 1.试剂配制 准备工作： 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins?高压灭菌。 电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 4、常用试剂及其配方： ▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 ▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5 三水合柠檬酸纳 22.94g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲10%肌氨酸钠： 肌氨酸钠 10g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲变性裂解液： 0.78M柠檬酸钠 8.25ml 10%肌氨酸钠 12.375ml 异硫氰酸胍 118.05g 加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用 临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v） PH=4.5 NaAc·3H2O 13.6g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲3M醋酸钠 PH=5 NaAc·3H2O 20.4g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用 ▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸): MOPS 41.86g NaAC·3H2O 4.10g 0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml 用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。 1x MOPS: 10x MOPS 30ml 加DEPC水270ml，用时现配。 ▲4x RNA Loading buffer: 10x MOPS 400ul 甘油（高压过） 200UL 溴酚兰 10ul 甲醛(37%) 72ul 去离子甲酰氨 310ul EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul 在4℃ 可保持3个月 10x PBS pH=7.4 NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4g KH2PO4 2.4g 定容至 1000ml ▲变性电泳胶： 称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。 ▲变性电泳缓冲液： 在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml 2.动物组织total RNA的提取 根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。 将组织样品放入变性