2014-4科内讲课资料分析.pptVIP

二、临 床 诊 断 应 用 治疗前 选择治疗的人群 选择治疗的时机 选择治疗的方案 治疗中 评价疗效、更换治疗方案、（治疗终点的确定 ? ) 治疗后 疗效持久性评估、监测复发 临床病原体 HBV HCV HIV 结核病（TB） 巨细胞病毒（CMV） 单纯疱疹病毒（HSV） 性传播疾病 1.沙眼衣原体（CT） 2.淋球菌（NG） 3.人乳头瘤病毒（HPV） 4.解脲支原体（UU） 性病PCR检测意义：常规的检测方法特异性不强，误诊率较高，而FQ-PCR具有快速、特异性强、敏感度高、无交叉反应等优点 ，有效地避免了假阴性假阳性的出现，结果真实可靠，具有指导意义。 血液标本抗凝剂的选择 检测RNA病毒，由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果，应使用EDTA抗凝，严禁使用肝素。 检测DNA病毒一般用EDTA-K2/Na2或枸橼酸钠抗凝，不可使用肝素。标本为血清时，应及时分离出血清，提取病毒DNA进行检测。 应避免溶血，脂类可干扰PCR反应 。 丙肝病毒（HCV）荧光定量 检测 谢谢大家！ * 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配 * 1 提取的核酸即可作为模板用于PCR反应 * 1 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点，在标准反应中采用三温度点法。 * * * * TaqMan荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 * * 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。 PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光基团和淬灭荧光基团分离。 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 * * 注：探针完整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收 * * PCR扩增时， Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解 * * 荧光基团和淬灭荧光基团分离 * * 每扩增一条DNA链， 就有一个荧光分子形成， * * PCR.swf原理flash * * 实时荧光定量PCR的特点 1.特异性强 FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。 2.灵敏度高 灵敏度可达到102拷贝，线性范围可到达102 －108拷贝。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝。 * * 3.重复性? FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的CT值相同，但其产物的荧光量却相差甚大。因为域值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。 荧光定量PCR的特点 * * 4.污染率小 全封闭的体系，有效地减小污染的机率。 5.方便、快速、准确 FQ-PCR周期短，自动化程度高，有非常严密的数学理论支持。 荧光定量PCR的特点 采血管 * * * * 乙肝病毒（HBV）荧光定量 检测 FQ - PCR 可以对乙肝病毒DNA 进行准确定量，在乙肝的预防、诊断、治疗上都具有显著的优越性。 HBV DNA监测在长征之路中的作用 慢性乙型肝炎核苷类似物应用路线图的中国临床应用 开始核苷类似物治疗 24周HBV DNA: 更合理的疗效预测点 12周HBV DNA: 评估治疗应答 HBV-DNA较基线下降 高度应答 2.0E2 IU/mL 中度应答 2.0E+2 IU/mL –2.0E+3IU/mL 低度应答 ≥ 2000IU/mL) 建议加用其他有效药物 继续治疗 每3月监测一次 继续治疗 每3月监测一次 52周时,如果200IU/mL 继续单药治疗 52周时,如200IU/mL 建议加用其他有效药物 52周时,如果(200IU/mL 继续单药治疗 52周时,如果103 copies/mL(200IU/mL) 建议加用其他有效药物 乙肝病毒（HBV）荧光定量 检测 慢性丙型肝炎的RGT治疗策略 * 内标法在抗病毒治疗中的意义 评价疗效更准确 决定治疗方案(药物的剂量？单药还是联合？疗程？） 改变策略（停药？再联合？) 治疗终点的选择 预测复发 超敏感（Hypersensitivity） —HBV最低检测限＜10-15 IU/ml 宽线性范围（ wider dynamic range ） —涵盖101~109 IU/ml 高特异性（ High specific