CRISPR基因编辑技术解析.pptVIP

* CRISPR/Cas 9 系统介绍 许 汪 盛程程 于艳超 周步丹 刘天昕 郭歆岩 CRISPR/Cas 9 背景 CRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌内，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列(既CRISPR序列)和CRISPR相关基因，这一序列首先由日本学者于1987年首次发现(1)，于2002年被Jansen等将正式命名(2)。由这些序列和基因组成的系统我们称之为CRISPR/Cas系统，而在这个系统中常用到的核酸内切酶为Cas9,所以通常称该系统CRISPR/Cas9 系统。利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。 CRISPR/Cas 9概述 CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 CRISPR/Cas系统的基本结构 识别作用 切割作用 CRISPR系统通常包括：由不连续的重复序列（repeats，R）与长度相似的间区序列（spacers，S）间隔排列而成的CRISPR簇，前导序列(leader，L)以及一系列的CRISPR相关蛋白基因(cas)。 Cas（CRISPR associated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它不需要形成二聚体才能发挥作用。 CRISPR的转录与加工 CRISPR簇首先转录成长的转录体，即（crRNA），然后逐步被加工成小的 crRNA。 CRISPR/Cas 9作用机理 CRISPR/Cas 9作用机理 PAM（NGG序列） CRISPR/Cas 9系统靶向要求 最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。 CRISPR/Cas 9基因编辑实验流程图 CRISPR/Cas 9的技术应用 应用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。 能够在真核细胞中发挥作用，使真核基因组中的特异性位点发生双链断裂。 在模式生物中的应用:成功地对线虫(左)、斑马鱼胚胎（中）和果蝇进行遗传学改造，获得更粗短的线虫，腹部组织体积更大的斑马鱼胚胎，和眼睛颜色更深的果蝇，表明CRISPR技术在动物基因改造方面有巨大应用潜力。 中国科学院遗传所高彩霞团队：成功地使三种水稻基因失活。 三大基因修饰技术比较 CRISPR/Cas 9系统的优势 操作简单，靶向精确性更高。sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。编码sgRNA 的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZENs更简单方便，用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。 CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。 基因修饰率高，CRISPRs基因敲入的效率为51%-79%，TALENs的效率为0%-34%。 基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等 无物种限制,可实现对靶基因多个位点同时敲除。 实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。(ZFNS一个靶点成本6000＄) CRISPR/Cas 9系统的评价 *