三DNA与RNA分析方法资料讲解.pptVIP

溴酚蓝的分子量为670，在不同浓度凝胶中，迁移速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂。 在0.6％、1％、2％的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1kb、0.6kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。 在5％的聚内烯酰胺凝胶和7－8mol/L尿素PAG中，分别与65mer和35mer的寡聚核苷酸迁移率相同。 二甲苯青的分子量为554.6，携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢，在5％PAG含7—8mol/L 尿素PAG的胶中迁移率分别相当于260mer和130mer的寡核苷酸。 根据分离样品中DNA分子的大小，可以参照指示剂 Bb 和Xc的迁移情况决定是否停止电泳指示剂。一般加在电泳上样缓冲液中，为了使样品能沉入胶孔，还要加入适星的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。 2. 聚丙烯酰胺凝胶的制备 原 理： 由过硫酸铵提供并可被TEMED（N’, N’, N’, N’-四甲基乙二胺）所稳定的自由基引发的一个链式反应,使丙烯酰胺单体聚合成长链。双功能基团N,N’-亚甲基双丙烯酰胺参与聚合反应时，链与链之间铰链成凝胶，其孔径由链长和交联度决定。 * 使用 TBE电泳缓冲液 * 凝胶在垂直装置中制备 聚丙烯酰胺凝胶形成过程示意 聚丙烯酰胺凝胶制胶装置 3．电泳：低电压（1- 8 V/cm）电泳，防止电流 通过时产生的热量引起小片段DNA变性。 * DNA条带迁移率与碱基组成和序列特征有关 4．特点: I 分辨率高，DNA的长度仅相差0.2% (1 bp) ii 所装载的DNA量远大于琼脂糖凝胶(?g) iii 回收的DNA的纯度很高 二、变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 目 的： 分离纯化单链DNA分子 原 理： 凝胶在可抑制核酸中碱基配对的试剂 (尿素，甲醛）的存在下聚合，变性的DNA在凝胶中的迁移率与碱基的组成及序列无关，只与DNA的片段大小相关。 应 用： 放射性探针的分离，S1核酸酶产物的分析，DNA测序反应产物的分析等。 变性的梯度凝胶电泳 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌、古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品。具有可重复和容易操作等特点，适合于调查种群的时空变化，并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落成员。 变性的梯度凝胶电泳 由 Fisher和 Lerman于1983年创立。以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。它主要是利用梯度变性胶来分离 DNA片段。电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小有关，而一旦 DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得 DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶上形成不同的条带。目前常用的变性剂有尿素 (urea)和甲酰胺 (formamide)。 一：核酸的提取； 二： 16SrRNA、18SrRNA或功能基因如可溶性甲烷加单氧酶羟化酶基因 (mmo X)和氨加单氧酶 α-亚单位基因 (amo A)片段的扩增； 三：通过DGGE分析 PCR产物 DGGE分析微生物群落的一般步骤如下： Bacterial 16S rRNA genes were PCR-amplied using a universal primer complementary to position 517-534 (5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3) and a bacterial primer complementary to position 341-358 plus a GC clamp (5-CGCCCGCCGCGC GCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3) (Muyzer et al. 1993). Lasse Riemann et al. Deep-Sea Research II, 1999, 46, 1791-1811 The depth range covered by each sample is S1 (