受体研究方法资料讲解.ppt

（二）部分区域背景着色 1.切片部分区域干燥。 2.显色反应物在封片介质中是可溶的，造成弥散。 （三）部分区域不着色 1.脱蜡不完全。 2.切片部分区域干燥。 （四）各种孵育结果所有抗体均不着色 1.H2O2终浓度不够或存放过久失效。 2.稀释液中有错误的正常血清（如猪抗兔酶标抗体稀释液中有正常兔血清）。 3.显色反应物溶于脱水的酒精、二甲苯或封片液中。 （五）某些抗体不着色 1.需要消化而没有消化。 2.封闭内源酶时使抗体活性下降。 3.切片在裱片或干燥时过热。 4.抗体过度稀释，一抗浓度小于二抗。 5.抗体过期或频繁冻融. （六）内源性酶活性： H2O2 -甲醇封闭不恰当。 （七）脱片 1.切片无粘附试剂。 2.切片不干净。 3.冰冻切片：组织在贴片前已经充分固定。 （八）核轮廓模糊 1.切片已干燥（特别是冰冻切片）。 2.苏木素染液欠佳。 （九）非特意性色淀 1.底物-显色液使用前未经过滤。 2.抗体使用前未离心。 （十）阳性反应太弱 1.抗体或其它试剂活性下降。 2.显色反应时间过短。 3.某些抗体的稀释度或孵育时间不够。 4.当加抗体时切片上缓冲液过多。 （十一）切片镜下模糊或黑点沉着 1.脱水不彻底：进入二甲苯前加一步等量石碳酸/二甲苯混合液。 2.温箱干燥替代脱水过程。 * * 原位杂交术（in situ hybridization） 即核酸分子杂交组织化学术，检测基因（DNA片段）的有无、基因的表达活性（mRNA） 原理：用带标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测核酸按碱基配对原则进行特异性原位结合（杂交），并通过对标记物的显示而获知待测核酸的有无及相对量 常用标记物：放射性核素、地高辛 * 探针（probe） DNA或RNA片断（一般30-40bp） 组织穿透力强 标记：同位素（放射自显影） 地高辛 图14 原位杂交 脐静脉内皮细胞呈心房钠尿肽阳性 * 放射自显影术（autoradiography） 概念：通过活细胞对某种放射性物质的特异性摄入，以显示该物质在组织和细胞内的分布、含量和代谢过程，借以反映细胞的功能状态 应用举例 ①用3H标记的胸腺嘧啶核苷研究DNA合成和细胞增殖状态 ②用125I 观察甲状腺滤泡内碘化部位 图15 放射自显影 示幽门部胃小凹底的干细胞 （3H标记的胸腺嘧啶核苷标记） * 3H的分辨率高，但放射自显影时间长，一般需几周或更长时间。 32P能量最大，放射自显影时间短，需几天，但分辨率低。 35S介于两者之间。 * 1. 18cm不锈钢高压锅或 电炉或医用微波炉； 2. 水浴锅 原位杂交操作 一. 仪器设备 * 二. 试剂 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。 0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。 0.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐 （用前加）2.5ml。 20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠 88.2g，H20 定容1L。 * 5. 100×Denhardts：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。 杂交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardts 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。 BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.15mol/L NaCl。 BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。 BufferⅣ（pH8.0）：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。 * 三. 操作流程 第一天1） 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟；2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4） PBS清洗3分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗10分钟； 使用地高辛标记 的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交 * 7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；8） PBS清洗2次，每次3分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟 12）PBS清洗2次，每次5分钟13）预杂交缓冲液孵育30分