植物基因转化资料.ppt

1 植物基因转化技术 农杆菌介导的转化 DNA直接转化植物 整株转化 叶绿体转化 植物病毒载体 2 黑莓藤上的冠瘿 冠瘿是一种植物肿瘤；冠缨组织是真正的瘤性转变组织． 农杆菌介导的转化 3 根瘤农杆菌诱导植物肿瘤 4 5 Ti质粒 Ti质粒（tumor-inducing plasmid）：Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子,与肿瘤诱导有关（200kb）。Ti质粒中有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA）（约23kb），能转移并整合到植物基因组中，并导致冠瘿瘤的形成。 6 Ti质粒结构 7 T-DNA区：T-DNA是根瘤农杆菌侵染植物细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱的基因 Vir 区：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根瘤农杆菌表现出毒性 Con 区(接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移 Ori区(复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制 Ti 质粒的4 个功能区域 8 植物表达载体构建—Onc卸甲载体（受体Ti质粒）的构建 野生型Ti质粒缺点 1.质量过大 2.酶切位点多 3.T-DNA区Onc基因干扰宿主激素平衡 4.不能在大肠杆菌中复制 5冗余基因 Onc卸甲载体：无毒的Ti质粒载体。切除了T-DNA中的Onc致癌基因。缺失部分被大肠杆菌的常用质粒pBR322区段（含Ampr)取代。任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。 9 10 改造后的Ti质粒的基本结构 左边界序列 右边界序列 DNA复制起始位点 选择标记基因 T-DNA的边界序列 多克隆位点 11 Ti质粒介导转化的过程 12 植物表达载体构建—中间载体的构建 带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为“中间载体”。 基本原理是把T区（即Ti质粒能整合到植物基因组中去的一段DNA，总长度约为23kb）片段克隆到普通载体pBR322上，把外源基因插入到该T区后再导回受体细胞中，使外源DNA转移到Ti质粒上，再经根癌土壤杆菌转化植物把该外源片段导入植物体内。 13 植物表达载体构建—共整合载体系统 14 植物表达载体构建—双元载体系统 15 16 双元载体杆菌与共整合载体区别 双元载体杆菌与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制，从大肠杆菌转移到农杆菌的频率比共整合质粒的转移频率高10000倍。且改造的Ti质粒时其多克隆位点无导入pBR322质粒的同源片段。 17 三亲交配法 无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都需要三种细菌参与，通常把这一过程称为三亲交配法。 1.受体农杆菌 2.协助菌（带有协助质粒的大肠杆菌） 3.供体菌（带有重组植物表达载体的大肠杆菌） 原理：三种菌混合时，协助质粒游动进入供体菌中，将供体菌中的表达载体转移到受体菌中，最后经过适当的抗生素筛选即可获得土壤农杆菌转化结合体 18 叶盘转化法 19 DNA直接转化植物-原生质体共培养转化法 以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。 优点：与叶盘转化法相比，此法得到的转化体不含嵌合体，一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体。应用此法进行基因转化时，其先决条件就是要建立起良好的原生质培养和再生植物技术体系。 20 整株感染法 人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质粒的根癌农杆菌注射到植物体内，使菌体在植物体内进行浸染实现转化。 21 植物病毒载体 植物病毒可以用作基因转移和表达的载体，这可以作为使用农杆菌或DNA直接转移来进行稳定转化的一种替代方法。 DNA病毒载体 花椰菜花叶病毒 双粒病毒 RNA病毒载体 烟草花叶病毒 马铃薯病毒X 22 23 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 2、T-DNA的结构与功能 边界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右边界序列是完全保守的，对T-DN