chapter3外植体选择和灭菌分析报告.pptVIP

第三章 外植体选择和灭菌 一般来说，无论何种类型的细胞工程技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种与培养等基本过程。 §1、外植体的选择和灭菌 一 外植体的选择 (一) 外植体的基因型 不同种类的植物 同一植物的不同器官 对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化的成功率高，有的部位却很难脱分化，或者再分化频率很低 (二)外植体的部位 常用的外植体种类： ①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限） ②茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） ③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）； ④花球和花蕾 ⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。 在选择植物外植体进行组织培养时，还要求考虑待培养材料的来源是否有保证，是否容易成苗；同时要考虑到该外植体，特别是经过脱分化产生的愈伤组织，是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状。 (三)取材季节 取材的季节以早春为好 (四)器官的生理状态和发育年龄 (五)外植体大小 外植体的大小 0.5-1cm， 过大的外植体容易污染， 过小存活率很低。 二、外植体的灭菌 　灭菌：是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀灭。 常用灭菌方法: 干热灭菌: 150度，40’ 　　　　 1２0度， 120 ’ 湿热灭菌:高压灭菌锅，压力达0.5kg/cm2时放气， 压力达1.1 kg /cm2,121度,16-30’ 射线灭菌:紫外灯 过滤灭菌:细菌过滤器（孔径0.45um ） 熏蒸灭菌:每立方米体积2-8mL甲醛 ＋甲醛一半量的高锰酸钾 火烧灭菌：酒精灯 药剂灭菌：外植体 (一 )外植体的灭菌 原则：杀菌又不伤害活细胞。（选择消毒剂，浓度、时间） 　　药剂：能自动分解成低毒性或容易除去的药剂，如次氯酸钠能分解成杀菌的氯气，并易散失，是常用的，低浓度氯化汞效果好但难除；多次无菌水冲洗，用镊子翻动使药液均匀。 幼穗、花蕾、花药：饱和漂白粉上清液10-20分钟 茎段、茎尖 ： 0.1-0.2%升汞5-10分钟 成熟胚：次氯酸钠 15-30分 （活性氯2.5%）（＞= 5.2% ） 厚种皮种子： 0.1-0.2%升汞30分-60分，幻胚次氯酸钠 90-120分 (二)污染原因和预防措施 ⑵真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。 污染途径： 周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大 （3）严格按照操作程序。 污染来源：空气中微生物，接种工具、材料、工作人员带菌 一、接种室的消毒 原则：杀菌又不伤害活细胞。（选择消毒剂，浓度、时间） 　　药剂：能自动分解成低毒性或容易除去的药剂，如次氯酸钠能分解成杀菌的氯气，并易散失，是常用的，低浓度氯化汞效果好但难除；多次无菌水冲洗，用镊子翻动使药液均匀。 幼穗、花蕾、花药：饱和漂白粉上清液10-20分钟 茎段、茎尖 ： 0.1-0.2%升汞5-10分钟 成熟胚：次氯酸钠 15-30分 （活性氯2.5%）（＞= 5.2% ） 厚种皮种子： 0.1-0.2%升汞30分-60分，幻胚次氯酸钠 90-120分 材料消毒前常用70%酒精漂洗：70%具较强穿透力和杀菌力，湿润表面，驱尽茸毛间气泡，使药剂杀菌效果好。但时间太长会损伤材料。 表面活性剂，抽气、搅拌或超声振动，使消毒剂与材料充分接触。 （三）工作人员：洗手，戴帽、口罩，70%酒精擦手。 （四）无菌操作：烧烤瓶口，换滤纸，消毒剪刀，在酒精灯下方操作等。 接种只是完成了离体培养的第一步，植物离体培养和栽培植物一样，生长过程中也受到各种环境因素的影响。培养条件是离体培养能否成功的关键。在培养基条件适宜的基础上，影响试管苗生长的主要因素有光照、温度、湿度、氧气。 马铃薯连续光照，葡萄要求短日照。 光质也影响芽的再生，蓝光有利于器官发生，烟草实验，而红光有利于根的发生。 一、 褐变的原因及防止措施 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。 一、 褐变的原因及防止措施 （一）褐变的原因 褐变是指外植体在培养