酵母Pub1-RRM2和RPA14的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析.pdfVIP

摘要 摘要 一、Publ-RRM2蛋白的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析 基因的表达在真核生物中是一个受高度调控的过程，主要包括转录水平的调 控和转录后水平的调控。mRNA的翻转(mRNAturnover)，主要通过定位于mRNA 上的顺式作用元件与作为反式作用因子的RNA结合蛋白之间的相互作用来介导 的，它在转录后水平的调控中发挥着极其重要的作用。RNA结合蛋白是真核生物 中普遍存在的一种蛋白，能特异性地与RNA或DNA结合，调控生物体代谢的多个 过程，发挥着非常重要的作用。RNA结合蛋白通常含有多种不同的结构域，而RNA 识别结构域(RNA motif，RRM)则是其中一个非常普遍的结构域， recognition 它能够与特定的RNA或DNA序列结合来调节其稳定性，并能参与蛋白一蛋白之间 的相互作用，是真核生物中一种非常重要的结构域。 Poly(O)结合蛋白1[Poly(U)bindingprotein1，Publ]是酵母细胞中的一 个非常重要的Poly(A)RNA结合蛋白，它在细胞质和细胞核中都有分布，并且其 有很强的结合能力和结合特异性，故此命名。Publ作为反式作用因子，主要通 过与含有AU序列(AU-rich elements， 的作用。此外研究还发现，Publ除调节mRNA的稳定性之外，还可能调控其代谢 mRNA的降解。但三个RRM的功能可能各不相同，而其中的第二个RRM可能特异 性地结合Poly(U)，并且决定整个Publ蛋白的结合特异性。 我们从酵母基因文库中克隆了Publ的第二个RRM序列，并构建了 coli Tag在E RRM2一pET22b质粒。重组蛋白RRM—HiS 的表达量，经过Ni亲和柱纯化和分子筛分离之后，蛋白的纯度达到95％以上， 凝胶液相层析分析表明蛋白在溶液中以单体形式存在，且SDS—PAGE显示蛋白没 有明显降解。用悬滴气相扩散法经过初筛和进一步优化后得到RRM的晶体，X-Ray 衍射分辨率达到1．69A并进行衍射数据的收集。数据处理结果显示晶体所属空 函数计算均表明，一个晶体学不对称单位中只含有一个蛋白质分子。以人源TIA一1 的第二个RRM为结构模型，用分子置换方法进行结构解析。 I 摘要 关键词： 第二个RRM晶体 二、RPAl 4蛋白的克隆、表达及纯化 聚合酶III。酵母细胞中的RNA聚合酶I由14个亚基组成，核心部分含有10个亚 能稳定RPA43与核心酶之间的相互作用。 coli 粒。重组蛋白RPAl4-HiS BL21(DE3)中表达量高，但蛋白比较 tag在E 难纯化，经过Ni柱亲合层析、分子筛和离子交换柱的纯化，蛋白纯度达到90％ 以上。对该蛋白进行了晶体生长，目前没有得到可用于衍射的晶体。 RPAl4RPA43 关键词：RNA聚合酶RNA聚合酶I Abstract and preliminary diffraction ofthesecondRRMofPublfrom X—ray analysis cere visia Saccharomyces In isa whichinvolv