红色荧光蛋白基因标记荧光假单胞菌的研究.pdf

摘耍 modifled 转基因徽生物(Genefically 具有重要作用，其在环境中的安全性闻题倍受关注。分子生态学技术的发展 为探明细菌的微生态行为提供了有效手段与技术支持。荧光假单胞菌作为重 要的生防细菌，起着越来越重要的作用，因而构建良好的荧光假单胞杆菌标 记系统是非常重要的。 本研究重缎荧光假单胞菌工程菌BioP8的环境生态安全性结果显示：工 为102 CFUIg；喷洒工程菌BioP8前后叶片上的芽孢杆菌数维持在 性菌落，说明BioP8的扩散能力很弱；BioP8在甘蓝植株根部的定殖实验显 示抗性菌落在浸根后1天和9天各出现一高峰值，之后逐渐恢复到浸根前的 水平，30天后，其在根部的密度为103CFU／g：BioP8悬浮剂防治小菜蛾田间 实验调查结果表明，工程菌BioP8速效性比化学农药对照差，防治后7、15 天，BioP8防治区对小菜蛾的防效逐步增加，分别达46．4％和85．7％，其防治 效果高于灭多威防治区：工程菌BioP8对甘蓝田中天敌种群的影响调查结果 表明几种主要天敌昆虫数量和对照区相当。而化防区天敌昆虫数量显著降低， 施药后3、7、15天分别比对照减少68．7％、62．5％和36．7％。处理对甘蓝田节 肢动物群落存在不同的影响，调查区甘蓝田节肢动物物种个体丰富度有所不 同，害虫丰富度依次为空白对照区化防区工程菌BioP8防治区；天敌个体 丰富度依次为工程菌BioP8防治区空白对照区化防区，化学农药对天敌的 影响较大，而生防区害虫的数量保持在较低的水平，蜘蛛和天敌均高于化防 区；工程菌对甘蓝的生长发育及其它病害发病情况调查结果表明，工程菌 BioP8在甘蓝田中不会诱发霾霉、软腐等甘蓝常见病害，也不会对甘蓝产生 致病性药害，对甘蓝的生长发育也无不良影响，其长势和化学农药区相当， 明显好于空白对照区。 用昆虫消化液处理RFP(red 虫消化液中能抵抗蛋白酶的作用，RFP在SDS．聚丙烯酰胺凝胶中非常稳定， 仍发出正常的红色荧光。这也证明了RFP稳定性很强，这些特性将能很好的 应用于Cry蛋白在害虫中肠的定位和作用机理等方藤的研究。 构建了含有红色荧光蛋白基因表达盒的质粒载体pJH3。将咖基因表达 盒分别插入Mini．Tn5转座子和插入到大肠杆菌一荧光假单胞菌穿梭载体 P303中得到转化子12P303。质粒标记工程菌外光下发出强烈的 红色荧光，而染色体标记工程菌在366nm紫外光下则发出微弱的红色荧光。 表达量在12小时到36小时是逐步提高的，36小时以后趋于稳定；8’P303的 蛋白表达量在12小时到60小时则比较稳定，并且质粒标记的蛋白表达量要 高于染色体标记的蛋白表达量。8’P303，12P303的生长曲线测定表明与野生 菌株P303生长特性无显著差异。遗传稳定性在98％以上，平板抑菌结果表明 室自然土壤实验结果表明30天内供试菌株群落总量呈逐步下降趋势，土壤中 可培养细菌总量在108 CFU／g土(湿重)左右，P303及其工程菌株在温室自 然土壤的定殖时间至少为30天，它们的消长动态相似。 本项研究丰富了分子生态学分析技术，为重组微生物环境监控的安全性 评价提供了新的研究手段，为工程菌株的产业化和生产应用提供直接的科学 依据，具有重要的理论意义和实践价值。 关键词：生物安全；红色荧光蛋白； 荧光假单胞菌；Mini．Tn5；穿梭载体 on Pseudomonas Study Marking Red Protein 歹llIo理sc拍s FkorescentGene by Abstract insectsand control Agriculturalpest YanhuaJia GuoxunLi Jie Zhang