基因克隆表达课件摘要.pptVIP

载体（vector）：携带外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 二、克隆载体 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。 共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因 5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区： RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录 各种启动子启动转录能力不同。 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点 转译起始密码子AUG 或GUG SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列 三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件： 删除内含子和5’非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。 常见原核强启动子： Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。 2、基因剂量： 3、核糖体结合位点： SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。 AUG—SD间距离。 AUG后的核苷酸 五．原核表达载体：? 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因 类型： 融合型表达载体：----融合蛋白 非融合型表达载体：---天然完整蛋白 分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙 （一）融合型表达载体 P SD Foreign DNA 融合型表达载体 融合基因 技术关键：克隆基因插入原核序列3’端而维持正确阅读框架。 选择合适酶切位点 加人工合成的DNA接头 构建位相载体 ----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT --- ----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA--- EcoRI BamHI AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA 载体部分序列 DNA序列 位相载体----含有3种读码框的系列载体 优点： 表达效率高 产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 易纯化：利用融合原核多肽的特性 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子 位相载体 融合型载体----pGEX系列 * 基因克隆技术 基因克隆的技术路线 目的基因 载体 体外重组 重组子（杂合DNA） 转化 受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA 一、载体的选择与准备（择）； 分类： 1.按功能 克隆载体（cloning vector） 表达载体（expression vector） 质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等 2.按基本元件的来源 1.至少有一个复制起点（origin of replication, ori） 2.至少有一个选择性标志（selection marker） 3.有适宜的限制性内切酶的单一切点：多克隆位点（multiple cloning sites，MCS） 4.应有较高的拷贝数 pBR322质粒图谱 三、受体细胞 1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不