一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法.pdfVIP

生物技术通报 ·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年第 期 2014 8 一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化 GST-TRAF6 融合蛋白的方法 张西轩  李晔  张振奇  董世瑞  赵培  阮海华 （天津商业大学 天津市食品生物技术重点实验室 生物技术与食品科学学院，天津 300134） 摘 要 ： 利用8 mol/L 尿素溶液对表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6 融合蛋白进行变性，通过逐级稀释复性的方法对 尿素溶解后的GST-TRAF6 融合蛋白进行复性，将复性后的GST-TRAF6 融合蛋白进一步利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法 进行分离纯化，将分离纯化后的蛋白通过Western blot 方法进行验证，最后利用体外泛素化反应检测经包涵体变性、复性和纯化 后的GST-TRAF6 融合蛋白的生物学活性。经过包涵体变性、梯度稀释复性和谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析3 个步骤后纯化得到纯 度达90% 以上、浓度为396 ng/μL 的蛋白质溶液。利用GST 蛋白作为对照，经Western blot 验证表明，纯化得到的蛋白确为GST- TRAF6 融合蛋白。进一步利用体外泛素化反应分析其泛素连接酶活性发现，17 ng/μL 浓度的GST-TRAF6 融合蛋白能够以泛素分子 作为底物在5 min 内快速催化自由泛素链的生成。结果表明，表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6 融合蛋白经尿素变性溶解后 能够成功复性并分离纯化，在溶解性改变的同时恢复了其泛素连接酶活性。为从大肠杆菌包涵体中大规模分离纯化蛋白质提供了 一种新的复性方法。 关键词 ： TRAF6 蛋白纯化 包涵体复性 重组蛋白 - Purification of GST TRAF6 Fusion Proteins from Inculsion Body Expressed in E. coli Zhang Xixuan Li Ye Zhang Zhenqi Dong Shirui Zhao Pei Ruan Haihua （Tianjin Key Laboratory of Food Science ＆Biotechnology ，College of Biotechnology ＆ Food Science ， Tianjin University of Commerce ，Tianjin 300134 ） Abstract:  There was only a minor fraction of GST-TRAF6 fusion proteins were observed soluble when expressed in E.coli. Most of the GST-TRAF6 fusion proteins were present in the inclusion body, in which the expressed proteins aggregate and exist in inactive. To obtain GST-TRAF6 fusion protein in a high yield and high pu