东海原甲藻增殖细胞核抗原基因表达量和生长关系研析.pdf

东海原甲藻增殖细胞核抗原基因表达量与生长关系的研究 摘 要 浮游藻是海洋食物链的重要一环，在能量转移和营养盐循环等方面起着重要 作用。对浮游藻现场生长率等基本生理生态学参数的测定，是估算浮游藻生产力、 研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测的基础，特别是现场测 定单种浮游藻的生长率显得尤为重要。但目前尚缺乏一种准确估算单一种类浮游 藻现场生长率的方法。近年来，国际上对细胞周期标志物的研究显示，增殖细胞 cellnuclear 核抗原(proliferatingantigen，PCNA)可能在浮游藻生长率研究中有巨 大的潜在应用价值，这为藻类生长率的估算提供了新的研究方向。 本研究以我国东海海域常见的赤潮藻——东海原甲藻(Prorocentrum 色素b基因的eDNA全长序列，分别设计了符合实时荧光定量PCR检测要求的 量PCR方法，系统研究了东海原甲藻PCNA基因表达量在不同细胞周期中的变 化及其与生长率之间的关系，为运用分子生物学技术实现东海原甲藻现场生长率 的估算奠定了基础。 ’主要研究结果如下： b)基因的cDNA全长序列，并分别对 b，Cyt 1124bp的细胞色素b(cytochrome b进行了序列比对和系统进化树分析。 PCNA和Cyt b基因序列，分别设计了符合实时荧光定量 (2)根据得到的PCNA与Cyt GreenI 所设计PCNA基因的I讧Q．PCR引物的特异性进行了分析。采用SYBR b基因的 染料和TaqMan探针两种荧光体系建立了检测东海原甲藻PCNA与Cyt Green I染料体系得到的曲线方程分 实时荧光定量PCR的标准曲线。采用SYBR 别为：对PCNA，Y=．3．403x+40．048，(r=0．999，其中X为细胞数对数值，Y 为CT值，r为相关系数)；对Cyt 对Cyt 建立标准曲线的准确性。 。(3)运用建立的定量PCR方法，系统研究了东海原甲藻PCNA基因表达量 b基因表达 在不同细胞周期中的变化及其与生长率之间的关系。结果表明，Cyt 稳定j平均单细胞表达量为(45．4+4．7)拷贝，在不同的生长阶段表达量变化很小， 是一个潜在的良好的内参基因。与此不同，平均单细胞中PCNA表达量在培养 的不同阶段变化较大，指数期的含量比平台期高4倍左右，说明PCNA表达量 与细胞分裂密切相关。以Cytb基因为内参基因，PCNA基因为目的基因，进一 步研究了不同培养条件下PCNA基因的相对表达量(REL)与生长率之间的关系， 结果发现，REL与生长率呈正相关性。 ． (4)以流式细胞术分析了同步培养的东海原甲藻的细胞周期，以RFQ．PCR 测定了PCNA基因表达量，研究了不同细胞周期中PCNA基因表达的变化。结 果表明，同其他物种的PCNA类似，东海原甲藻PCNA表达与细胞周期相关， 表达量从GI后期开始升高，在S期表达量最高。 本研究为建立PCNA相对表达量与东海原甲藻生长率之间的关系，进而运 用分子生物学技术实现东海原甲藻现场生长率的估算奠定了基础。 关键词：东海原甲藻；生长率；细胞周期；增殖细胞核抗原；细胞色素b The ofthe betweenthe cell study relationship proliferating nuclear levelandthe of antigengeneexp